★ 肖雪 馬晉芳 羅國(guó)安（1.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院 廣州 510006；2.清華大學(xué)化學(xué)系 北京 100084；3.中山大學(xué)南沙研究院 廣州 511458；4.中山大學(xué)藥學(xué)院 廣州 510006）

板藍(lán)根（Isatidis Radix）為十字花科植物菘藍(lán)（Isatis tinctoriaL.）的根，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，主要用于溫?zé)岵“l(fā)熱、頭痛、喉痛，或溫毒發(fā)斑、痄腮、癰腫瘡毒、丹毒、大頭瘟疫等多種熱毒熾盛之證［1-2］。在近十年中，板藍(lán)根在抗擊非典、甲流等傳染病中發(fā)揮了重要的作用［3-5］。雖然板藍(lán)根在臨床中應(yīng)用廣泛，但是板藍(lán)根抗病毒成分的質(zhì)量控制指標(biāo)不完善［6-8］，《中國(guó)藥典》（2015年版）僅規(guī)定了（R，S）-告依春作為板藍(lán)根水溶性成分的含量測(cè)定項(xiàng)。本試驗(yàn)擬從化學(xué)物質(zhì)組學(xué)［9］的角度，開(kāi)展不同產(chǎn)地板藍(lán)根中抗病毒化學(xué)物質(zhì)組的含量測(cè)定研究，在既往的研究基礎(chǔ)［10］上，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定板藍(lán)根中文獻(xiàn)中報(bào)道的抗病毒化學(xué)物質(zhì)組-尿苷、腺苷、鳥苷和（R，S）-告依春的含量。本研究可為不同產(chǎn)區(qū)板藍(lán)根質(zhì)量評(píng)估提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200 series LC液相色譜系統(tǒng)（包括：二元梯度泵、二極管陣列檢測(cè)器、柱溫箱、Chemstation化學(xué)工作站等）（美國(guó)Agilent公司）；XS105型電子天平（d=0.01mg，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司）；SL300N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；RUG-5200型超聲波清洗器（上海銳祺電子設(shè)備有限公司）；XJD-250B型微型高速粉碎機(jī)（姜堰市銀河儀器廠）；Milli-Q超純水儀（默克密理博公司）。

1.2 材料 尿苷（批號(hào)110887-200202）、腺苷（批號(hào)110879-200202）、（R，S）-告依春（批號(hào)111753-201304）對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定院；鳥苷（批號(hào)1309326-61607015）標(biāo)準(zhǔn)品采購(gòu)于Sigma公司；甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)默克公司），甲酸、乙醇等為分析純（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

板藍(lán)根藥材，產(chǎn)地分別為河南（HN）、河北（HB）、東北（DB）、甘肅（GS）、甘肅河西（HX）、甘肅武威（WW）、安徽（AH）、黑龍江（HLJ），由廣州白云山明興制藥有限公司提供，經(jīng)該公司陳文榮高級(jí)工程師鑒定為十字花科植物菘藍(lán)（Isatis tinctoriaL.）的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色 譜 條 件［9］色 譜 柱：Phenomenex C18柱（4.60mm×250mm，5μm），流動(dòng)相條件：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～12%B（0～42min），12%～19%B（42～65min）；流速：0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm、240nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量：10μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取尿苷對(duì)照品4.42mg，腺苷對(duì)照品4.93mg，鳥苷對(duì)照品4.84mg，（R，S）-告依春對(duì)照品3.54mg，分別置10mL容量瓶中量瓶中，用10%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各取適量置于10mL量瓶中，加入10%甲醇溶液至刻度，搖勻配制成一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取板藍(lán)根粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.5g，精密加入10%甲醇50mL，稱定重量，超聲處理（功率300W，頻率50KHz）10min后，再回流提取50min，放冷，用10%甲醇補(bǔ)足缺失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 空白干擾試驗(yàn) 取供試液、尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春的混合對(duì)照液和缺板藍(lán)根的空白液，各進(jìn)樣10μL。結(jié)果表明尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春對(duì)照液和供試品溶液均呈現(xiàn)吸收峰，而空白液在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上沒(méi)有色譜峰出現(xiàn)，如圖1所示，表明本測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 板藍(lán)根標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖（A）與空白對(duì)照?qǐng)D（B）

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值。以尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春的回歸方程分別為：Y=29923X+25300，R2=0.9997；Y=44814X+116966，R2=0.9996；Y=56713X+74922，R2=0.9998；Y=131480X+72635，R2=0.9999。尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春分別在 4.416～441.6μg/mL、4.848～484.8μg/mL、4.928～492.8μg/mL、3.356～353.6μg/mL 范 圍 內(nèi) 線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春含量的RSD（%）依次為0.96、0.84、0.84、0.65，說(shuō)明本方法精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取板藍(lán)根藥材按照藥材供試品制備方法平行制備供試品6份，結(jié)果尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春含量的RSD（%）依次為2.8、2.4、1.1、1.1，說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照供試品溶液制備方法制備一份供試品，分別在0、2、4、6、8、12、24h進(jìn)樣，結(jié)果尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春含量的RSD（%）依次為1.1、0.84、0.93、1.1，說(shuō)明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一組板藍(lán)根藥材，加入各成分對(duì)照品適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，尿苷、腺苷、鳥苷、（R，S）-告依春的平均加樣回收率分別為99.64%、98.85%、98.94%和100.10%。結(jié)果如表1。

2.10 樣品測(cè)定 按照供試品溶液的制備方法制備8個(gè)產(chǎn)地板藍(lán)根樣品，按照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量，色譜圖如圖2，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 加樣回收率考察結(jié)果

圖2 各產(chǎn)地板藍(lán)根藥材HPLC圖（A：HN，B：HB：C：DB，D：GS；E：HX；F：WW；G：AH，H：HLJ；1.尿苷，2.腺苷，3.鳥苷，4.（R，S）-告依春）

表2 各產(chǎn)地板藍(lán)根藥材抗病毒成分含量 μg/mL

3 討論

3.1 提取方法的選擇 有文獻(xiàn)報(bào)道按照藥典方法，通過(guò)水提醇沉工藝來(lái)考察板藍(lán)根中核苷類成分的含量［11］，此方法容易產(chǎn)生誤差，結(jié)合文獻(xiàn)［12］本文通過(guò)加約100倍量10%甲醇溶液在超聲處理后，再進(jìn)行回流提取，操作簡(jiǎn)單易行。

3.2 流動(dòng)相的選擇 已有文獻(xiàn)報(bào)道用HPLC法測(cè)板藍(lán)根藥材及其制劑中尿苷、鳥苷、腺苷、（R，S）-告依春中一個(gè)或多個(gè)成分的含量［12-15］。本試驗(yàn)在文獻(xiàn)［10］研究的基礎(chǔ)上所選擇的0.1%甲酸水和乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫的色譜條件，可用于板藍(lán)根的藥材、飲片制備、制劑等相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制。

3.3 化學(xué)物質(zhì)組學(xué)研究 化學(xué)物質(zhì)組學(xué)是指一定條件下輸入生物體系的所有化學(xué)物質(zhì)（化學(xué)成分）組成的復(fù)雜化學(xué)體系，其研究的是在復(fù)雜性科學(xué)理論的指導(dǎo)下，采用層次化、系統(tǒng)化及逐步優(yōu)化的研究策略，而且首先要強(qiáng)調(diào)整體有效，即能夠產(chǎn)生預(yù)期的生物學(xué)響應(yīng)［9］。有文獻(xiàn)報(bào)道板藍(lán)根中的鳥苷、腺苷、尿苷等核苷有抗病毒作用，近年來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn)（R，S）-告依春的抗病毒活性，而且在板藍(lán)根這四種活性成分含量較高，可以將其看成一個(gè)化學(xué)物質(zhì)組作為板藍(lán)根質(zhì)量控制的指標(biāo)，進(jìn)一步控制板藍(lán)根藥材的質(zhì)量以及板藍(lán)根在抗病毒中成藥中的應(yīng)用。

3.4 結(jié)論 由表2可知，每個(gè)產(chǎn)地的板藍(lán)根藥材所含的核苷類成分含量較大，如果以核苷類成分作為主要控制指標(biāo)，則HB、DB、HX三地產(chǎn)板藍(lán)根質(zhì)量較好；如果以（R，S）-告依春作為含測(cè)指標(biāo)，則AH產(chǎn)板藍(lán)根質(zhì)量較好，其他地區(qū)所產(chǎn)板藍(lán)根（R，S）-告依春的含量差別不大；如果以化學(xué)物質(zhì)組總含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，則AH產(chǎn)、HB產(chǎn)和DB產(chǎn)板藍(lán)根質(zhì)量較好。同樣，以甘肅地區(qū)為例，每個(gè)產(chǎn)區(qū)指標(biāo)的含量差異也比較明顯，沒(méi)有特別的規(guī)律性。本試驗(yàn)所收集的樣本尚較少，每個(gè)產(chǎn)區(qū)僅一批樣品，尚不足以代表各個(gè)產(chǎn)區(qū)板藍(lán)根的質(zhì)量，本試驗(yàn)僅以此作為一研究思路供研究使用。