劉婷，李丹，張燕，孟新玲

本研究創(chuàng)新點：

骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種炎性因子，在各種慢性炎癥和自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用。既往的體內(nèi)和體外實驗表明OPN表達增強很可能是應對加速的神經(jīng)退行性變和病理性變化時的反應。但有關結果多局限在動物實驗階段，臨床上確切的炎癥致病機制尚未完全明確。輕度認知障礙（MCI）被認為是介于認知正常和癡呆之間的一種疾病。有關早期識別進展為AD的MCI患者的潛在生物標記物研究較少，通過尋找血清和腦脊液中對MCI和癡呆診斷、預警有幫助的蛋白標志物是全世界學者追求的目標。因此，本研究創(chuàng)新點在于從嶄新的角度探索AD臨床前期和疾病早期新的生物學標志，探索AD不同時期、不同認知功能狀態(tài)下OPN及相關細胞因子的變化，為AD的篩查、預警和早期診斷提供客觀依據(jù)，為AD治療藥物的選擇提供一定的參考，并且為AD的治療效果評價提供客觀指標。

阿爾茨海默?。ˋD）是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特征是慢性進行性認知功能衰退［1］。輕度認知障礙（MCI）被認為是介于老年人認知正常和癡呆之間的一種疾病。一部分患有MCI的個體可能進展為AD，并具有典型癡呆的生物學變化［2］。

迄今為止，AD中神經(jīng)元和突觸變性的潛在機制仍未十分清楚，但炎癥過程和免疫失調(diào)參與其發(fā)病機制的理論已被廣泛證實。神經(jīng)病理學和神經(jīng)放射學研究表明，AD腦中的炎性變化是相對早期的致病事件，早于神經(jīng)的破壞過程［3-4］。但是目前用于早期識別進展為AD的MCI和不進展的MCI的生物標志物較少。因此，本研究擬通過對骨橋蛋白（OPN）及細胞炎性因子的研究尋找潛在的生物標志物，為評估OPN以及炎性因子在MCI患者進展為AD中的預測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻性分析2015年6月—2017年6月新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院腦病一科收治的MCI患者以及年齡、性別相匹配的非炎癥性神經(jīng)病變（OND）患者，各60例。患者均由家屬簽署知情同意書并通過醫(yī)院倫理委員會審查。

納入標準：（1）結合臨床表現(xiàn)及影像學檢查明確診斷為MCI或OND；（2）年齡≥50歲；（3）既往無腫瘤及精神疾病等病史；（4）視聽功能完好，可完成記憶量表檢測，無認知功能障礙；（5）簽署知情同意書。MCI的診斷標準是指：（1）主訴記憶障礙，而且有知情者證實；（2）總體認知功能正常，但有某一認知方面的變化；（3）日常生活能力正常，可能會影響社會活動、人際交往、工作能力、家庭生活；（4）未達到癡呆的診斷標準；（5）排除癡呆和其他可引起腦功能障礙的內(nèi)科或精神心理癥狀［5］。OND是指由非炎癥性因素引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)性頭痛等。

排除標準：（1）入院時患精神病或神經(jīng)障礙，顱腦損傷導致的意識喪失，酒精或藥物濫用；（2）伴隨可能影響免疫水平疾病，如糖尿病、嚴重的肺炎、自身免疫性疾病、風濕性關節(jié)炎、急性或慢性炎癥疾病等；（3）伴隨重大軀體疾病并危及生命，如急性心肌梗死、嚴重慢性阻塞性肺疾病；（4）抽血化驗期間使用皮質(zhì)類固醇激素及非甾體類抗炎藥物；（5）拒絕簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 收集基線資料 患者入院后收集以下臨床數(shù)據(jù)資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、簡易智能量表（MMSE）評分。MMSE是一種認知篩查工具，用于評估時間和空間定位、記憶力、注意力、計算、語言和視覺能力。由20個問題共30項組成，最高得分為30分。文化程度為文盲＜17分、小學＜20分、中學以上＜24分為癡呆。入院患者常規(guī)行腰椎穿刺留取腦脊液標本，晨起空腹抽取肘靜脈血5 ml，以3 000 r/min離心10 min，離心半徑150 mm，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測腦脊液和血清OPN水平（R＆D公司，美國）、血清白介素（IL）-1β、IL-6、IL-17A、轉化生長因子（TGF）-β1、腫瘤壞死因子（TNF）-α和IL-4水平（R＆D公司，美國），作為患者的基線數(shù)值。

1.2.2 隨訪 所有患者主要通過門診和住院隨訪1年，隨訪截止日期為2018-06-01，對失訪病例按最后1次隨訪時間為準做刪失處理。

1.2.3 分組方法 根據(jù)患者的診斷在隨訪結束時分為AD組、未進展組和OND組。當AD組診斷為AD時再次按照上述方法測量腦脊液和血清中OPN及各炎性細胞因子水平。對比分析各組隨訪前后的差異，以及MMSE評分、OPN以及各炎性細胞因子的相關性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗；計數(shù)資料的分析采用χ2檢驗；采用Pearson相關進行相關性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料 隨訪1年后，MCI患者中有23例發(fā)展為AD，5例失訪；OND患者中有9例失訪。最終AD組23例，未進展組32例，OND組51例。

入院時，3組性別、年齡、BMI、MMSE評分、血清 OPN、IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α、TGF-β1和IL-4水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；入院時3組腦脊液OPN水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中AD組腦脊液OPN水平高于未進展組和OND組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

隨 訪 1年 時，3組 IL-1β、IL-6、IL-17A、TGF-β1、IL-4水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；隨訪1年時3組血清OPN、TNF-α水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中AD組血清OPN、TNF-α水平均高于未進展組和OND組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 相關性分析 相關性分析結果顯示，所有入組患者在入院時腦脊液OPN水平與MMSE評分呈正相關（r=0.348，P＜0.001，見圖1）。血清 OPN水平與MMSE評分呈正相關（r=0.631，P＜0.001，見圖2）。血清TNF-α水平與MMSE評分呈負相關（r=-0.435，P＜0.001，見圖 3）。

2.3 隨訪1年后各項炎性因子變化結果 AD組患者入院時、診斷AD時、隨訪1年時IL-1β、IL-6、IL-17A、TNF-α、TGF-β1、IL-4水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；AD組患者入院時、診斷AD時、隨訪1年時MMSE評分、腦脊液OPN、血清OPN水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；其中診斷AD時、隨訪1年時MMSE評分低于入院時，腦脊液OPN、血清OPN水平高于入院時，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

圖1 腦脊液OPN水平與MMSE評分的相關性分析Figure 1 Correlation analysis of CSF OPN level and MMSE score

表1 兩組臨床資料比較Table 1 Comparison of general data between the two groups

3 討論

MCI被認為是介于認知正常和癡呆之間的一種疾病。一部分患有MCI的個體會進展為AD，并具有典型癡呆的生物學變化［2］。研究表明MCI患者的腦脊液和血清中含有多種促炎物質(zhì)，如細胞因子、急性期蛋白和補體蛋白，其在誘導認知衰退、記憶喪失和癡呆中起著重要作用［6-7］。其中OPN已經(jīng)被證實可以通過多種機制在慢性炎癥和自身免疫疾病的進展中發(fā)揮作用，包括參與產(chǎn)生Th1和Th17等炎癥疾病的致病性T細胞［8-9］，以及與其受體（如CD44等）相結合抑制自身反應性免疫細胞的凋亡和白細胞向炎癥部位遷移和黏附而發(fā)揮抗炎作用［10］。但是目前用于早期識別進展為AD的MCI和不進展MCI的臨床標志物很少。因此，本研究擬通過對OPN以及炎性細胞因子的研究尋找潛在的生物標志物。

圖2 血清OPN水平與MMSE評分的相關性分析Figure 2 Correlation analysis of serum OPN level and MMSE scores

圖3 血清TNF-α水平與MMSE評分的相關性分析Figure 3 Correlation between serum TNF-α level and MMSE scores

注：與入院時比較，aP＜0.05

本研究橫向研究顯示，在入院時僅腦脊液OPN水平在AD組中顯著升高，在未進展的MCI組與OND組無顯著性差異。但當AD組隨訪1年后腦脊液OPN和血清OPN水平、TNF-α水平均高于入院基線值。分析認為由于剛診斷為AD時，炎性反應主要發(fā)生在腦的脆弱區(qū)域，如內(nèi)嗅、顳頂葉和扣帶回皮質(zhì)，引起急性期蛋白和促炎遞質(zhì)的表達增加。而腦脊液內(nèi)的炎性因子可以直接接觸大腦，能準確反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)正在進行的炎癥過程［11］。因此與血清OPN相比，腦脊液OPN水平在發(fā)生認知功能下降前已經(jīng)發(fā)生變化。此外本研究還發(fā)現(xiàn)其他炎性因子在各組之間均無顯著差異，與既往研究相似［12］。何璐等［12］進行的70種免疫及炎癥相關蛋白研究也證實，除TNF-α外，AD組和健康對照組IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17A等常見的炎性細胞因子相比無顯著差異。但也有研究和薈萃分析顯示，AD患者外周血中IL-6、IL-8、IL-10水平高于健康對照者［13-15］。可能是因為本研究中排除標準較為嚴苛，嚴格排除了AD以外其他可能影響免疫炎癥水平的各種相關伴隨疾病。因此認為MCI患者進展為AD時，并不是所有的促炎因子和抗炎因子均發(fā)生改變。相關性分析也證實，腦脊液OPN水平和血清OPN水平、TNF-α水平均與癡呆嚴重程度具有相關性。研究認為當發(fā)生感染、炎性疾病、局部缺血和創(chuàng)傷性損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理過程時，會刺激腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞釋放大量的炎性因子［16］，并且對AD患者死亡后的大腦分析發(fā)現(xiàn)TNF-α 可以定位在淀粉樣斑塊中［17］。COMI等［18］也證實在MMSE評分＞23分的AD患者中腦脊液OPN含量高于MMSE評分≤23分，與認知功能下降有關。盡管OPN作為AD患者認知功能減退的關鍵促炎細胞因子的確切作用及其潛在機制尚不清楚，但既往研究發(fā)現(xiàn)與健康對照者和未進展的MCI患者相比，進展為AD的MCI患者的腦脊液中OPN的磷酸化C末端片段增加［19］。為確定AD癥狀前階段的蛋白質(zhì)變化，有學者利用高分辨率液相色譜質(zhì)譜對家族性AD患者或有遺傳危險者的腦脊液進行蛋白質(zhì)組學分析，結果表明，家族性AD突變載體的腦脊液OPN較相關非載體升高，提示臨床癡呆前腦脊液OPN發(fā)生變化［20］。在進展為AD的MCI患者的腦脊液中，不僅OPN的完整形式增加，而且OPN的裂解形式也增加［21］。

本研究縱向隨訪研究顯示隨訪1年后，AD組MMSE評分無顯著變化，腦脊液和血清OPN水平、TNF-α水平均較診斷為AD時無顯著變化。這與JULIAN等［22］進行的一項為期2年的隨訪研究相似，研究顯示AD患者隨訪期間未發(fā)現(xiàn)任何急性或慢性炎癥狀態(tài)，各項炎性因子亦無顯著差異。分析認為可能是與OPN在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展過程中的兩種相反作用共同作用導致。一方面，OPN通過上調(diào)髓鞘形成和再髓鞘形成發(fā)揮神經(jīng)保護劑的作用。另一方面，OPN通過引起神經(jīng)元毒性和死亡而具有疾病加速作用。隨著疾病進程和嚴重程度發(fā)揮不同的作用［23-24］。

結合既往研究和本研究結果均提示腦脊液OPN是一種潛在早期評估MCI進展的生物學標志物，在AD的病理生理機制中發(fā)揮重要作用。本研究缺陷在于，首先由于為單中心研究，在排除標準上限制了大量會影響免疫功能的伴隨疾病，以及部分患者在隨訪期間資料不全，與其他研究相比1年后進展為AD的比率偏高，仍需進一步多中心前瞻性研究證實該結論。其次，本研究僅評估了少量炎性細胞因子的變化情況，由于檢測指標和平臺的差異，還需進一步大樣本研究發(fā)現(xiàn)更多的預測標志物。最后，本研究隨訪1年后未能收集未進展MCI組腦脊液中OPN變化情況，因此仍需進一步研究證實該結論。

總之，腦脊液OPN水平是早期識別進展為AD的MCI患者的潛在生物標志物。并且血清及腦脊液OPN水平以及TNF-α水平與AD的嚴重程度具有相關性，但對于其他炎性因子與AD病情嚴重程度的關系仍有待于進一步研究。

作者貢獻：劉婷、孟新玲進行文章的構思與設計、研究的實施與可行性分析；劉婷進行數(shù)據(jù)收集、結果的分析與解釋、撰寫論文、進行論文的修訂；劉婷、張燕進行數(shù)據(jù)整理；李丹、張燕進行統(tǒng)計學處理；孟新玲負責文章的質(zhì)量控制及審校、對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。