孫銘維 童津津 蔣林樹(shù)* 熊本海

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

隨著綠色生物聚合物的使用越來(lái)越多，殼聚糖越來(lái)越受到廣泛關(guān)注。殼聚糖由甲殼素獲得，而甲殼素是天然大分子中最豐富的多糖，是一種可從甲殼綱、真菌[1]和昆蟲(chóng)[2]中提取的生物聚合物。殼聚糖通過(guò)用30%～60%氫氧化鈉將甲殼素脫乙?；@得[3]，具有良好的吸附性、吸濕性、成膜性、通透性以及較好的生物相容性、生物降解性和低過(guò)敏等特性[4]，還具有抗微生物[5]、抗腫瘤和降膽固醇血癥等功能[6]。其中，殼聚糖由于良好的抗菌作用在畜牧業(yè)尤其是在反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵、免疫以及疾病預(yù)防和治療方面有很大的應(yīng)用潛力。本文基于最新研究結(jié)果重點(diǎn)討論了殼聚糖的生物活性、作用方式及其影響因素，為殼聚糖在反芻動(dòng)物上的研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 殼聚糖的結(jié)構(gòu)特性和生物活性

1.1 結(jié)構(gòu)特性

殼聚糖是甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，有甲殼素脫去C2上的乙酰基而得到，學(xué)名為(1,4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖。通常，甲殼素的脫乙酰度達(dá)到55%即可稱為殼聚糖。所以殼聚糖是N-脫乙?；问降募讱に睾途哂胁煌潭萅-乙?；木€性多糖，其由低于20%的β-(1,4)-2-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖和超過(guò)80%的β-(1,4)-2-氨基-D-吡喃葡萄糖組成，是D-葡糖胺和N-乙酰-D-葡糖胺單元的無(wú)規(guī)共聚物。殼聚糖這2種單體單元之間的比例(脫乙?；潭?和分子質(zhì)量在殼聚糖的抗微生物活性和在水性介質(zhì)中的溶解度中起著重要作用[7]。殼聚糖含有3種類型的反應(yīng)性官能團(tuán)，分別為C2、C3和C6位上的氨基/乙酰氨基以及伯羥基和仲羥基。氨基含量是其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)之間差異的主要原因，并與其螯合、絮凝和生物功能有關(guān)[8]。殼聚糖，尤其是高分子質(zhì)量的殼聚糖在稀酸溶液中不溶于水且黏度很高，因此限制了其在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。而通過(guò)改性殼聚糖，即合成殼聚糖衍生物是影響其溶解度和抗微生物活性的重要方法之一。由于D-氨基葡萄糖的伯氨基、伯醇功能及其反應(yīng)性的差異，我們可以直接制造多種不同的殼聚糖衍生物，進(jìn)而改善殼聚糖的溶解性和增強(qiáng)抗微生物活性的功能。

1.2 生物活性

殼聚糖由于具有良好的生物活性引起了人們的廣泛關(guān)注，并且在食品、制藥、農(nóng)業(yè)和環(huán)境工業(yè)眾多領(lǐng)域應(yīng)用：包括用于農(nóng)用化學(xué)品[9]、植物防御反應(yīng)激活劑[10]、廢水處理中的絮凝劑[11]、殼聚糖基水凈化膜[12]、食品包裝或食品保鮮[13]、藥物乳化劑[14]和傷口敷料[15]。

最近的研究顯示殼聚糖具有抗微生物[16]、天然抗氧化[17]、抗炎和抗菌[18]、降膽固醇血癥[19]、免疫增強(qiáng)和抗腫瘤[6]、藥物傳遞[20]以及加速鈣和鐵吸收[21]等作用。雖然對(duì)殼聚糖生物活性的研究眾多，但并沒(méi)有單一類型的殼聚糖發(fā)揮上述所有生物活性，因此對(duì)殼聚糖生物活性的研究正在增加。此外，不同的殼聚糖衍生物和酶產(chǎn)物具有不同的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)，這可能導(dǎo)致已知生物活性化合物的新的生物活性或新的發(fā)現(xiàn)。

2 殼聚糖的作用方式

由于殼聚糖的作用方式受到不同因素的影響[22]，很難明確抗菌活性背后的具體機(jī)制。研究表明，影響殼聚糖作用方式最重要的因素是微生物類型[23-24]、分子質(zhì)量[22，24]和脫乙酰度。微生物類型大致可以分為4類：革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、殼聚糖敏感性真菌和殼聚糖抗性真菌[23]。眾多研究表明殼聚糖在真菌或細(xì)菌的細(xì)胞表面發(fā)揮作用，最終導(dǎo)致膜的通透性發(fā)生改變[25]。這種相互作用主要是靜電作用[23，26]，并且發(fā)生于殼聚糖質(zhì)子化氨基產(chǎn)生的正電荷與細(xì)胞表面帶負(fù)電的分子之間。通常，細(xì)胞表面通透性改變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[27]。研究表明殼聚糖也可以通過(guò)與核酸結(jié)合而影響DNA表達(dá)[24，28]。然而，在殼聚糖可以觸發(fā)這些特定的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)之前，它必須穿透質(zhì)膜，這很大程度上取決于微生物的種類和分子質(zhì)量。

2.1 對(duì)真菌的作用方式

與革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌相反，殼聚糖敏感性和抗性真菌作用方式之間的差異不明顯。首先，殼聚糖通過(guò)與帶負(fù)電荷的磷脂電荷相互作用影響細(xì)胞膜[23]。一旦細(xì)胞膜被破壞，殼聚糖就能夠進(jìn)入細(xì)胞[23]，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致DNA或RNA合成抑制并且中斷蛋白質(zhì)合成[28]。Palma-Guerrero等[23]用殼聚糖處理殼聚糖敏感性真菌觀察到細(xì)胞膜的破壞，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏以及殼聚糖滲透到細(xì)胞膜中。然而，對(duì)于抗殼聚糖的真菌，似乎殼聚糖不能穿過(guò)細(xì)胞膜并保留在膜外表面，這與殼聚糖敏感性真菌相反。殼聚糖不能破壞殼聚糖抗性真菌細(xì)胞膜的原因是由于細(xì)胞膜的流動(dòng)性存在差異。對(duì)殼聚糖敏感性和抗性真菌細(xì)胞膜磷脂脂肪酸組成的研究表明，殼聚糖活性的增加與細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸含量增加有關(guān)；通過(guò)測(cè)試殼聚糖在減少不飽和脂肪酸含量的情況下對(duì)粗糙脈孢菌突變體的抗微生物活性，結(jié)果表明殼聚糖對(duì)野生型粗糙脈孢菌的抗微生物活性降低[23]。這表明膜流動(dòng)性影響了殼聚糖的活性，而且作用方式在很大程度上取決于真菌本身。

顯然，殼聚糖敏感性和抗性真菌屬于不同的真菌家族[23]。分類方法基于脂肪酸組成，并且已被證明是用于分類真菌的有力工具[29]。這表明該分類可用于預(yù)測(cè)或解釋殼聚糖的抗真菌活性。同一研究小組還表明，殼聚糖敏感性真菌對(duì)殼聚糖的吸收是ATP依賴性的[30]。這可以通過(guò)監(jiān)測(cè)4 ℃或疊氮化物存在下的殼聚糖吸收來(lái)證明，2種處理均抑制ATP產(chǎn)生，并且在2種情況下殼聚糖都不能通過(guò)質(zhì)膜。在室溫和沒(méi)有疊氮化物的情況下，在不到30 min內(nèi)可觀察到殼聚糖吸收[28]。這表明殼聚糖吸收不僅與擴(kuò)散有關(guān)，而且還與ATP密切相關(guān)。一旦殼聚糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，它就會(huì)影響DNA或RNA合成以及蛋白質(zhì)合成[28]。

2.2 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的作用方式

對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，殼聚糖與磷壁酸非共價(jià)結(jié)合在肽聚糖層[31]。細(xì)胞表面的這些磷壁酸對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞分裂和生理學(xué)其他方面發(fā)揮重要作用[32]，但殼聚糖對(duì)細(xì)胞膜本身的影響仍不確定。一些研究小組認(rèn)為殼聚糖不太可能影響細(xì)胞膜，因?yàn)闅ぞ厶堑牧黧w動(dòng)力學(xué)直徑大于肽聚糖結(jié)構(gòu)中預(yù)期的孔徑[31]。然而，Park等[24]發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于5 ku的殼聚糖樣品通過(guò)阻斷DNA的合成而在巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)中誘導(dǎo)凋亡。這表明分子質(zhì)量是影響殼聚糖通過(guò)細(xì)胞膜的作用模式和滲透性的重要因素。通過(guò)測(cè)試缺少1種或多種涉及磷壁酸生物合成的基因的金黃色葡萄球菌突變體，表明了磷壁酸對(duì)殼聚糖活性的重要性。與野生型相比，金黃色葡萄球菌的突變種更具抗性，這表明需要聚陰離子磷壁酸來(lái)提高殼聚糖對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抗菌活性[31]。磷壁酸的功能大致可分為三大類：保護(hù)環(huán)境脅迫、控制細(xì)胞膜中酶活性和陽(yáng)離子濃度以及與受體和細(xì)胞表面的結(jié)合[33]。值得注意的是，殼聚糖與這些磷壁酸的靜電相互作用可能破壞磷壁酸的功能，并且這可能導(dǎo)致細(xì)胞功能的破壞[34]。由于這些陰離子磷壁酸的存在，其他陽(yáng)離子殺菌劑也表現(xiàn)出對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的抗菌活性。從這些結(jié)果可以說(shuō)明，殼聚糖主要的作用方式與磷壁酸的靜電相互作用有關(guān)，這種靜電作用可以破壞細(xì)胞的多種功能從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2.3 對(duì)革蘭氏陰性菌的作用方式

對(duì)于革蘭氏陰性菌，有2種被認(rèn)為在外膜上發(fā)揮活性的機(jī)制：一種是當(dāng)pH高于酸度系數(shù)(pKa)時(shí)，殼聚糖與不同陽(yáng)離子的螯合作用相關(guān)[35]，這可能導(dǎo)致細(xì)胞壁完整性被破壞并干擾重要營(yíng)養(yǎng)素(鈣離子、鎂離子等)的吸收[22]；另一種是殼聚糖與外膜脂多糖陰離子部分的靜電相互作用[36]。但關(guān)于哪種機(jī)制占主導(dǎo)地位仍不確定。最近的研究表明，殼聚糖干擾了內(nèi)膜功能[36-37]，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外漏[37]。此外，已觀察到殼聚糖能夠穿過(guò)革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞膜[24，37]，表明殼聚糖可能干擾DNA或RNA合成并觸發(fā)細(xì)胞的胞內(nèi)反應(yīng)。

總之，陰離子細(xì)胞表面和殼聚糖之間的靜電相互作用是決定殼聚糖抗真菌和細(xì)菌抗微生物活性的重要因素。這反映在隨著脫乙酰度的增加，抗菌活性提高，且甲殼素的抗菌活性較低[38]。由于含有質(zhì)子化的氨基，殼聚糖(pKa為6.3～6.5)在低pH下具有最好的抗微生物特性。這也解釋了為什么季銨化殼聚糖衍生物通常比殼聚糖更有效[39]。盡管靜電相互作用非常重要，殼聚糖也能夠與膽固醇非共價(jià)結(jié)合[26]。這表明其他非共價(jià)相互作用也可能在抗微生物活性中發(fā)揮作用。

3 影響殼聚糖抗微生物活性的因素

殼聚糖可以用作針對(duì)不同類型的真菌和細(xì)菌的抗菌劑。然而，殼聚糖的活性和作用方式受到很多因素的影響。一般來(lái)說(shuō)，殼聚糖主要在細(xì)胞表面有活性。根據(jù)微生物類型和分子質(zhì)量的不同，可能會(huì)引發(fā)其他抗微生物活性，如抑制DNA或RNA合成或破壞蛋白質(zhì)合成。

3.1 抗真菌

在最近的研究中，測(cè)試了具有相似脫乙酰度的不同分子質(zhì)量殼聚糖對(duì)3種真菌的作用效果，結(jié)果表明低分子質(zhì)量殼聚糖(分子質(zhì)量41.2 ku)似乎是最有效的，但針對(duì)不同的真菌相同分子質(zhì)量展現(xiàn)了不同的作用效果[40]。這表明，殼聚糖作用方式很大程度上取決于真菌。另一項(xiàng)研究報(bào)道，一方面,低分子質(zhì)量殼聚糖(分子質(zhì)量17.4 ku)對(duì)匍匐莖的菌絲體生長(zhǎng)更有效;但另一方面，高分子質(zhì)量殼聚糖(分子質(zhì)量307 ku)對(duì)匍匐翦股穎的孢子發(fā)育更有效[41]。

除了分子質(zhì)量之外，脫乙酰度是抗真菌活性的關(guān)鍵因素。不同的研究表明，增加脫乙酰度會(huì)導(dǎo)致抗真菌活性增加[42]。一般而言，當(dāng)脫乙酰度較高且分子質(zhì)量較低時(shí)，抗真菌活性增加。這在對(duì)白色念珠菌測(cè)試不同分子質(zhì)量和脫乙酰度的殼聚糖樣品抗菌活性的研究中得到證實(shí)[42]。殼聚糖與帶負(fù)電的磷脂之間的靜電相互作用是作用模式的重要因素，而增加脫乙酰度會(huì)導(dǎo)致游離氨基更多，從而使聚合物上有更多的正電荷，導(dǎo)致靜電相互作用增強(qiáng)。然而，與分子質(zhì)量相似，脫乙酰度的程度仍然取決于真菌的類型，這在Younes等[43]通過(guò)測(cè)試分子質(zhì)量和脫乙酰度對(duì)3種真菌的影響試驗(yàn)中得到證明。

3.2 抗革蘭氏陽(yáng)性菌

與抗真菌活性相似，殼聚糖抗菌活性在很大程度上取決于分子質(zhì)量、乙?；潭?、環(huán)境影響和細(xì)菌類型[44-45]。一般而言，殼寡糖與殼聚糖相比對(duì)細(xì)菌具有較低的抗菌活性，而殼聚糖的作用很大程度上取決于細(xì)菌類型[46]。與殼寡糖相比，較長(zhǎng)的鏈(殼聚糖)被證明是更有效的，如果將殼聚糖不同分子質(zhì)量之間進(jìn)行比較，中高分子質(zhì)量殼聚糖活性似乎是更好的，這表明理想的鏈長(zhǎng)很大程度上取決于細(xì)菌的類型[47]。

分子質(zhì)量和乙?；潭葘?duì)蠟樣芽孢桿菌3種菌株生長(zhǎng)的影響研究表明具有高度去乙酰作用的低分子質(zhì)量殼聚糖(分子質(zhì)量36.0～93.3 ku)更有效[48]。脫乙酰度與殼聚糖和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的磷壁酸之間的靜電相互作用有關(guān)。因此，如果脫乙酰度增加，則抗菌活性增加，此結(jié)果在蠟狀芽孢桿菌[49]、單核細(xì)胞增生李斯特菌[45，49]、金黃色葡萄球菌[45，50]和無(wú)乳鏈球菌[45]等上面都得到了證實(shí)。這背后的原因與抗真菌活性相同，當(dāng)脫乙酰度增加時(shí)，更多的游離氨基可以被質(zhì)子化，導(dǎo)致帶正電荷的殼聚糖，這種效應(yīng)與較低pH下增加的抗微生物活性有關(guān)。

3.3 抗革蘭氏陰性菌

殼聚糖對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌活性，與革蘭氏陽(yáng)性菌類似，分子質(zhì)量的影響在很大程度上取決于細(xì)菌的類型。同殼聚糖相比，殼寡糖顯示出較低的抗菌活性[44]。一項(xiàng)研究調(diào)查了寡殼聚糖(分子質(zhì)量2、3、6、10和16 ku)和低分子質(zhì)量殼聚糖(分子質(zhì)量60 ku)針對(duì)多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)和普通擬桿菌(Bacteroidesvulgatus)的抗菌活性，結(jié)果表明，當(dāng)殼寡糖樣品的分子質(zhì)量增加時(shí)，抗菌活性增加；盡管如此，低分子質(zhì)量殼聚糖被證明比殼寡糖更有效[51]。Tayel等[52]也得出相同結(jié)果，此外還發(fā)現(xiàn)不同分子質(zhì)量殼聚糖之間的差異很小，很大程度上取決于細(xì)菌，而且細(xì)胞膜的破裂是抑菌的主要作用模式。

對(duì)于殼聚糖的脫乙酰度而言，同樣隨著脫乙酰度增加，抗菌活性增加。這在有關(guān)革蘭氏陰性細(xì)菌(大腸桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、銅綠假單胞菌和副溶血性弧菌)的研究[44]中得到證實(shí)。

4 小 結(jié)

殼聚糖是一種高度研究的多功能生物聚合物，在不同領(lǐng)域顯示出眾多優(yōu)良特性。其中最有前途的是殼聚糖及其衍生物的抗微生物活性。這種抗菌作用不僅受真菌或細(xì)菌類型的影響，而且主要受脫乙酰度、分子質(zhì)量以及所用的衍生化和制備方法的影響。結(jié)合這些特性，將殼聚糖合理應(yīng)用到動(dòng)物生產(chǎn)上，用以提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，例如改變反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵模式，增加飼料利用率。此外，殼聚糖在動(dòng)物疾病預(yù)防與治療方面有極大的應(yīng)用潛力。