楊會會，婁芳慧，韓二芳，古洋，錢志偉

（河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品工程學(xué)院，鄭州451450）

0 引 言

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥（Pyrethroid Pesticides）是一種高效低毒的殺蟲劑，但是過量的使用仍然會導(dǎo)致哺乳類動物長期接觸低劑量的殘留菊酯。研究表明擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等存在一定的毒性。因此，中國、日本和歐盟均對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在谷物、食用菌、香蕉和乳制品等產(chǎn)品中的殘留量做出了嚴(yán)格的規(guī)定。

香蕉酸奶是一種具有多種保健作用的功能性食品[1]，近年來出現(xiàn)大量關(guān)于香蕉酸奶制作工藝方面的研究[2-3]。但是目前擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的研究主要集中在果蔬[4～6]、茶葉[7]和藥材[8]等方面，關(guān)于香蕉酸奶中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的檢測尚未見報道。

該實(shí)驗(yàn)采用Q uEChERS法對香蕉酸奶樣品進(jìn)行前處理，實(shí)現(xiàn)低耗高效的檢測效果，為香蕉酸奶的安全監(jiān)督提供便捷可靠的檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B-5977A氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，湘儀臺式高速冷凍離心機(jī)，漩渦振蕩儀，超聲波萃取儀，氮吹儀。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量濃度100 m g/L）：聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯；正己烷、乙腈、丙酮、二氯甲烷（色譜純試劑）；無水硫酸鎂（分析純）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

分別用微量注射器精確吸取200μL各擬除蟲菊酯標(biāo)準(zhǔn)品至2 m L容量瓶中，用正己烷定容。則混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各組分的質(zhì)量濃度均為10m g/L。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

（1）提取。稱取4.0 g左右香蕉酸奶樣品至離心管中，向其中加入10 m L乙腈。渦旋1 min后用超聲波萃取儀提取20 min（超聲功率比：30%；超聲開/關(guān)：3.0 s/3.0 s），再向離心管中加入4 g無水硫酸鎂，渦旋1 min。在4℃低溫條件下以8 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另外一潔凈離心管中。向呈有酸奶樣品的離心管中再次加入5 m L乙腈，渦旋振蕩1 min，而后在4℃低溫條件下以8 000 r/min離心5 min，取上清液。合并兩次提取所得上清液。

（2）凈化。向裝有提取液的離心管中加入300m g無水 MgSO4，300 m g PSA和 100 m g C18；渦旋振蕩2 min，在4℃低溫條件下以轉(zhuǎn)速為8 000 r/min離心5 min，取上清液至氮吹管中，在70℃的情況下氮吹至近干，而后用正己烷復(fù)溶至1.0m L，經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過濾至氣相色譜進(jìn)樣瓶中，用GC-M S測定。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。Agilent HP-5色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：250℃，進(jìn)樣量為1μL。程序升溫：初始溫度180℃，保持1 min，以25℃/min升溫至240℃，保持2 min，以0.5℃/min升溫至242℃，保持1 min，以8℃/min升溫至260℃，保持8min，以10℃/min升溫至280℃；后運(yùn)行溫度為285℃，運(yùn)行3 min。載氣：He，純度≥99.999%。

（2）質(zhì)譜條件。溶劑延遲時間為3 min；色譜-質(zhì)譜傳輸線溫度為280℃；離子源溫度為230℃；離子化方式為EI；四級桿溫度為150℃；電子能量為70 eV，測定方式為SIM，各組分定性及定量條件如表1所示。

表1 5種擬除蟲菊酯農(nóng)藥的保留時間和特征離子

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥均屬于帶負(fù)電荷的弱極性物質(zhì)，選用非極性或弱極性色譜柱更有利于目標(biāo)化合物的分離。常用于分離擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的毛細(xì)管色譜柱為HP-5（非極性）和DB-1701（弱/中等極性），實(shí)驗(yàn)中所涉及的幾種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥沸點(diǎn)相對比較高，其中氰戊菊酯和溴氰菊酯農(nóng)藥的沸點(diǎn)均為300℃。HP-5和DB-1701毛細(xì)管色譜柱的最高使用溫度分別為350℃和300℃，為防止柱流失現(xiàn)象出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)過程中選擇HP-5毛細(xì)管色譜柱對5種擬除蟲菊酯農(nóng)藥進(jìn)行分離。測定過程中經(jīng)過多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終確定程序升溫條件，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜如圖1所示。由圖1可以看出，5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的色譜峰峰形尖銳且響應(yīng)較好，能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)化合物的有效分離。

圖1 5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖

2.2 擬除蟲菊酯提取條件優(yōu)化

向空白樣品中加入相同體積的擬除蟲菊酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別考察提取溶劑、提取次數(shù)和超聲提取時間對測定結(jié)果的影響。

2.2.1 提取溶劑的選擇

實(shí)驗(yàn)分別考察了正己烷、乙腈、丙酮和二氯甲烷對香蕉酸奶中5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的提取效果。四種有機(jī)溶劑作為提取試劑時加標(biāo)回收率分別在62.9%～90.8%，84.2%～104.4%，71.9%～84.9%和73.17%～90.2%之間；具體結(jié)果如圖2所示。香蕉酸奶本身富含脂肪，以丙酮和正己烷作為提取試劑時，溶劑將樣品中的脂類也提取出來，導(dǎo)致干擾物質(zhì)增加，并且丙酮作為提取試劑時回收率總體偏低。二氯甲烷對三氟氯氰菊酯和氰戊菊酯的提取效果不太好，并且二氯甲烷本身毒性比較大，對實(shí)驗(yàn)操作人員的損害比較大。相比較而言，乙腈穿透力強(qiáng)，易滲入至細(xì)胞組織，更容易將5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥從樣品中提取出來，并且樣品中油脂等雜質(zhì)也不易被乙腈提取出來[9]，避免提取液中其他成分過多導(dǎo)致儀器受污染。因此該實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈作為提取試劑。

圖2 提取試劑對5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥回收率的影響

2.2.2 提取次數(shù)的選擇

提取次數(shù)可能對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的回收率產(chǎn)生比較大的影響。在超聲功率比為30%，超聲開3.0 s而后關(guān)3.0 s的條件下，實(shí)驗(yàn)依次考察了使用乙腈對酸奶中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥提取1～4次時目標(biāo)物質(zhì)的回收率，具體操作為：第一次提取時向加標(biāo)樣品中加入10m L乙腈和4 g無水硫酸鎂，渦旋1 min+超聲萃取20 min，離心后取上清液；第二次提取時向首次提取后的樣品中加入5m L乙腈，渦旋1min，離心取上清液；第三、四次提取方法與第二次提取相同，合并上清液。對四分空白加標(biāo)樣品分別進(jìn)行提取1～4次操作，考察其回收率，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，僅提取1次時5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的回收率總體偏低，在67.1%～83.3%之間；提取兩次時目標(biāo)物質(zhì)的回收率在87.8%～101.6%之間，已經(jīng)能夠滿足實(shí)驗(yàn)需求，隨著提取次數(shù)增加各組分回收率提高的程度比較小，與此同時也會帶來試劑用量大、操作時間延長、共提取雜質(zhì)增多等不利因素，為后期提取液的凈化和上機(jī)測定帶來較大的干擾。因此實(shí)驗(yàn)最終選擇用提取次數(shù)為兩次。

圖3 不同提取次數(shù)對5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥回收率的影響

2.2.3 超聲提取時間的選擇

香蕉酸奶中的很多組分容易與擬除蟲菊酯類農(nóng)藥結(jié)合，單純以振蕩或渦旋的形式很難徹底的實(shí)現(xiàn)酸奶中擬除蟲菊酯農(nóng)藥的提取。因而，實(shí)驗(yàn)選用渦旋+超聲萃取的形式提高5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的回收率。渦旋振蕩1 min后將離心管置于超聲萃取儀上，在超聲功率比為30%、超聲開3.0 s而后關(guān)3.0 s的條件下分別考察未超聲、超聲5，10，15，20 min和超聲25 min處理后樣品的測定情況，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，在0～20 min范圍內(nèi)，5種擬除蟲菊酯農(nóng)藥的回收率總體成增長趨勢，當(dāng)提取時間為25min時甲氰菊酯和三氟氯氰菊酯的回收率反而降低。這可能是因?yàn)樵?～20min內(nèi)隨著超聲時間延長，樣品中細(xì)胞破裂逐步完全，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥逐漸被釋放出來；20 min后細(xì)胞破碎已經(jīng)基本到達(dá)最大程度，持續(xù)的超聲所產(chǎn)生的熱效應(yīng)反而可能會導(dǎo)致部分?jǐn)M除蟲菊酯類農(nóng)藥分解，造成其回收率降低。因此實(shí)驗(yàn)最終選擇超聲時間為20min。

2.3 凈化條件優(yōu)化

PSA（N-丙基乙二胺）是一種常用的吸附劑，能夠有效的除去香蕉酸奶提取液中的金屬離子、糖類、酚類、極性的脂肪酸和色素等雜質(zhì)。C18（十八烷基鍵合硅膠）可以除去提取液中弱極性色素、維生素、脂類和固醇類。研究證明，PSA和C18同時添加時對于脂類的凈化效果會更好[10]，實(shí)驗(yàn)選擇PSA-C18混合試劑作為凈化劑。與此同時，加入適量的無水M gSO4能夠進(jìn)一步降低提取液中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，有助于提高凈化效果。凈化提取液過程中固定無水M gSO4加入量為300m g，依次優(yōu)化PSA和C18的使用量。

圖4 不同超聲時間對5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥回收率的影響

在空白加標(biāo)條件下，分別比較了提取液中PSA加入量為100，150，200，250，300 m g和350 m g時5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的回收率，發(fā)現(xiàn)PSA加入量為300 m g時各組分回收率最高，在78.3%～90.2%之間，當(dāng)PSA加入量為350m g時，各組分回收率并沒有明顯的提高。而后在PSA含量為300 m g的基礎(chǔ)上，比較C18含量分別為0，50，100，150 m g和200 m g時的凈化效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)C18加入量為100 m g時回收率達(dá)到82.8%～97.5%（詳細(xì)結(jié)果見圖5），能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求，C18加入量增加后各組分回收率并無明顯提高，并且聯(lián)苯菊酯和溴氰菊酯的回收率反而有所下降，可能是因?yàn)椴糠洲r(nóng)藥被C18吸附的緣故，為保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性并節(jié)省實(shí)際用量，最終確定C18吸附的用量為100 m g。故實(shí)驗(yàn)選用300m g PSA和100mg C18混合試劑作為凈化劑。

圖5 吸附劑PSA(300mg)-C18(100mg)時5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的回收率

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 方法的線性范圍及檢出限

為了避免基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果產(chǎn)生影響，實(shí)驗(yàn)中采用基質(zhì)空白溶液作為溶劑稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制濃度為0.05，0.10，0.50，1.00，2.00，2.50 m g/L和3.00 m g/L的5種擬除蟲菊酯標(biāo)準(zhǔn)系列，經(jīng)GC-M S測定后，以化合物的峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得各組分的回歸方程及相關(guān)系數(shù)R2。以3倍信噪比計算各組分的檢出限，結(jié)果見表2。5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥質(zhì)量濃度在0.05～3.00 m g/L之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限在0.60～1.83μg/kg之間。

2.4.2 精密度與回收率

在香蕉酸奶中加入擬除蟲菊酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其提取凈化后質(zhì)量濃度分別為0.20，0.75 m g/L和1.00 m g/L，每個水平平行測定5次，結(jié)果如表3所示。

可以看出，各組分在三個不同加標(biāo)濃度下回收率在82.5%～104.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.1%～6.4%之間，能夠滿足測定要求。

表2 5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的線性方程及方法檢出限

表3 5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)束語

建立了QuEChERS-氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對香蕉酸奶中5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的測定方法。分別從色譜工作條件、提取試劑、超聲時間和凈化試劑4各方面對實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了香蕉酸奶中5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的測定方法。經(jīng)驗(yàn)證該方法在低、中、高三個級別的加標(biāo)情況下回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合實(shí)驗(yàn)要求，能夠滿足樣品測定需求。