胡文輝，童孟新，陳躍躍，謝玄，王赟

(雅培（嘉興）營(yíng)養(yǎng)品有限公司檢測(cè)中心，浙江嘉興314000)

0 引 言

黃曲霉毒素是一類(lèi)由黃曲霉和寄生黃曲霉等真菌產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相似的次級(jí)代謝產(chǎn)物，目前發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有20多種，其中黃曲霉B1是目前所有已知致癌物中致癌能力最強(qiáng)的一種，對(duì)人和動(dòng)物的肝臟組織具有破壞作用，被世界衛(wèi)生組織定為甲類(lèi)致癌物[1]。因此加強(qiáng)黃曲霉B1的檢測(cè)準(zhǔn)確性研究，對(duì)保障食品安全具有重要的意義。

本文依據(jù)JJF1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[2]對(duì)影響嬰幼兒配方乳粉中黃曲霉B1測(cè)定結(jié)果的不確定度評(píng)定和討論，為評(píng)定檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，配有熒光檢測(cè)器；美國(guó)Pickering Vector PCX柱后衍生儀；M ettler XP204電子天平；美國(guó)O rganom ation氮吹儀；W aters 20位固相萃取裝置。

1.2 試劑

o2si品牌黃曲霉B1標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）；M erck甲醇（色譜純）；M erck乙腈（色譜純）；碘（分析純）；水（GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水）。

1.3 方法

按照GB5009.22-2016《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》中的柱后衍生法進(jìn)行[3-4]。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制過(guò)程

移取0.85 m L黃曲霉毒素B1（質(zhì)量濃度3 m g/L）于25 m L容量瓶中，用乙腈定容于25 m L容量瓶中。分別精確移取10，50，200，500，1 000，2 000，4 000μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)中間液，用初始流動(dòng)相定容于10 m L容量瓶中。

1.5 樣品制備過(guò)程

稱(chēng)取5 g（精確至0.000 1 g）試樣，置于100m L容量瓶中，加水80m L，搖勻，超聲30 min，取出放置至室溫，加水稀釋至刻度。在4500 rpm/min下離心15 min。取50 m L的乳試樣，過(guò)黃曲霉免疫親和柱，4 m L乙腈洗脫，蒸干后用1m L流動(dòng)相溶解，過(guò)0.2μm濾膜進(jìn)樣。

2 數(shù)學(xué)模型

試樣中，黃曲霉B1的殘留量按下式計(jì)算：

式中：X為試樣中黃曲霉B1質(zhì)量分?jǐn)?shù)，μg/kg；C為測(cè)定用試樣溶液中的黃曲霉B1質(zhì)量濃度，ng/m L；V1為樣品定容總體積，m L；V2為樣品用于過(guò)免疫親和柱的樣品體積，m L；V3為樣品經(jīng)過(guò)免疫親和柱后最終定容體積，m L；m為樣品稱(chēng)樣量，g。

3 不確定度分量分析

根據(jù)數(shù)學(xué)模型分析，影響被測(cè)量X的不確定度分量包括如下：

（1）隨機(jī)因素對(duì)測(cè)量結(jié)果X的影響帶來(lái)的不確定度分量（采用A類(lèi)評(píng)定的方法）。

（2）系統(tǒng)因素對(duì)測(cè)量結(jié)果X的影響帶來(lái)的不確定度分量為：①試樣中黃曲霉B1濃度C引入的不確定度分量（采用B類(lèi)評(píng)定的方法）；②樣品在制備過(guò)程中引入的試樣體積V1、V2、V3的不確定度分量（采用B類(lèi)評(píng)定的方法）；③稱(chēng)量引入的樣品質(zhì)量m的不確定度分量（采用B類(lèi)評(píng)定的方法）。

4 不確定度評(píng)定

4.1 隨機(jī)因素對(duì)X測(cè)量結(jié)果的影響

隨機(jī)因素對(duì)X測(cè)量結(jié)果的影響帶來(lái)的不確定度分量uA（X）采用A類(lèi)評(píng)定的方法。為獲得樣品溶液重復(fù)測(cè)量的不確定度分量，對(duì)自制陽(yáng)性樣品進(jìn)行10次獨(dú)立的測(cè)定，計(jì)算得出最終結(jié)果，樣品中黃曲霉B1的含量數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

重復(fù)性測(cè)定的平均值計(jì)算：

按貝塞爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差S（X）為

日常檢測(cè)中采用2次測(cè)量結(jié)果的平均值作為報(bào)告結(jié)果，所以測(cè)量結(jié)果X對(duì)應(yīng)的不確定度A類(lèi)評(píng)定結(jié)果為

相對(duì)不確定度為

4.2 系統(tǒng)因素對(duì)測(cè)量結(jié)果帶來(lái)的不確定度

系統(tǒng)因素對(duì)測(cè)量結(jié)果X帶來(lái)的不確定度分量uB(X)采用B類(lèi)評(píng)定的方法。

4.2.1 試樣中黃曲霉B1質(zhì)量濃度C的不確定度分量

試樣中黃曲霉B1質(zhì)量濃度C的不確定度分量采用B類(lèi)評(píng)定的方法。試樣中黃曲霉B1濃度引入的不確定度包括：標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程中玻璃儀器校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度。

（1）由標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)引入的不確定度分量（采用B類(lèi)評(píng)定的方法）。查閱標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)證書(shū)，其中給出的標(biāo)準(zhǔn)值，黃曲霉B1為（2.999±0.08）m g/L。按正態(tài)分布考慮，包含因子k=2，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

相對(duì)不確定度為

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程中玻璃儀器校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度分量采用B類(lèi)評(píng)定的方法。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程使用了一系列玻璃量具和移液器，認(rèn)為其服從矩形分布，故k=3，由此估算不確定度分量。查閱各玻璃儀器檢定證書(shū)，其中給出該儀器的準(zhǔn)確度等級(jí)為A級(jí)，對(duì)照J(rèn)JG 196《常用玻璃儀器檢定規(guī)程》和JJG 646《移液器檢定規(guī)程》[5-6]，得知該玻璃儀器的允許誤差。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中用到的玻璃量具和移液器引入的不確定度如表2所示。

表2 玻璃量具和移液器引入的不確定度

由表2中數(shù)據(jù)合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）黃曲霉B1標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度分量。用液相色譜儀測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液峰面積，采用最小二乘法進(jìn)行曲線擬合，得黃曲霉B1標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=5650000X+11600,相關(guān)系數(shù)為0.999920，由線性方程得到試樣中黃曲霉B1的質(zhì)量濃度C=4.7382 ng/m L。再由標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和線性方程計(jì)算出峰面積的理論計(jì)算值，如表3所示。

則由擬合曲線求C時(shí)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

式中：s為由貝塞爾公式求出的標(biāo)準(zhǔn)曲線剩余標(biāo)準(zhǔn)差；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；p為樣品測(cè)量的次數(shù)；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線上標(biāo)準(zhǔn)工作液的數(shù)目；ci為標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點(diǎn)待測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量濃度；-c為標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點(diǎn)待測(cè)物質(zhì)質(zhì)量濃度的平均值。因此，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（4）試樣中黃曲霉?jié)舛菴的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。假定各不確定度分量之間不相關(guān)，所以系統(tǒng)因素對(duì)C測(cè)量結(jié)果帶來(lái)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

4.2.2 樣品制備過(guò)程中引入的試樣體積的不確定度分量

樣品制備過(guò)程中引入的試樣體積V1，V2，V3的不確定度分量采用B類(lèi)評(píng)定的方法。樣品在制備過(guò)程使用了100 m L容量瓶，50 m L移液管和1 m L移液管，認(rèn)為其服從矩形分布，故k=3，由此估算不確定度分量。查閱玻璃儀器檢定證書(shū)，其中給出該儀器的準(zhǔn)確度等級(jí)為A級(jí)，對(duì)照檢查玻璃儀器檢定規(guī)程和移液器檢定規(guī)程，得知該玻璃儀器的允許誤差。樣品制備過(guò)程中用到的玻璃量具引入的不確定度如表4所示。

表4 玻璃量具引入的不確定度

4.2.3 稱(chēng)量引入的樣品質(zhì)量的不確定度分量

稱(chēng)量引入的樣品質(zhì)量m的不確定度分量(采用B類(lèi)方法評(píng)定。稱(chēng)量5.0020 g樣品所用的天平為M ettler XP204，其最大允許誤差為±0.1m g，采用矩形分布，包含因子為 3，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

4.2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量

測(cè)量結(jié)果X的數(shù)學(xué)模型為

表5 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

假定各不確定度分量之間不相關(guān)，所以系統(tǒng)因素對(duì)X測(cè)量結(jié)果帶來(lái)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

X=1.8950μg/kg。

所以合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為uB（X）=0.1042μg/kg。

4.3 合成不確定度

4.4 擴(kuò)展不確定度

當(dāng)置信概率p=95%時(shí)，包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度為

4.5 結(jié)果報(bào)告

高效液相色譜柱后衍生法測(cè)得乳粉中黃曲霉B1質(zhì)量分?jǐn)?shù)X=1.90μg/kg，其擴(kuò)展不確定度為0.22μg/kg，其中k=2。

5 結(jié)論

通過(guò)對(duì)不確定度的分析和計(jì)算，可以得出，主要是不確定度A類(lèi)評(píng)定中的測(cè)量重復(fù)性和B類(lèi)評(píng)定中的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)不確定度的影響較大。因此采用高效液相色譜柱后衍生法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中的黃曲霉B1應(yīng)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，保證實(shí)驗(yàn)具有良好的重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性。