吳偉林，楊 帆，孟章進(jìn)，姜桂英，方 芝

（江蘇油田石油工程技術(shù)研究院，江蘇揚(yáng)州 225009）

油田經(jīng)長期注水開發(fā)，地層水中已形成了較為穩(wěn)定的微生物群落，在低于100℃的較淺的地層中，微生物群落較為復(fù)雜，種類多且數(shù)量大，以細(xì)菌為主，主要包括石油烴降解菌、脫氮菌、產(chǎn)甲烷菌、硫酸鹽還原菌、鐵細(xì)菌、硫細(xì)菌和腐生菌等。這些細(xì)菌在地層環(huán)境長期生存的過程中，產(chǎn)生了較強(qiáng)的適應(yīng)性[1]。這些微生物的存在對水質(zhì)有很大影響，在油田水系統(tǒng)中尤以硫酸鹽還原菌（SRB）、鐵細(xì)菌（FB）和腐生菌（TGB）對水質(zhì)的影響最大。

傳統(tǒng)的富集培育、分離鑒定的生物學(xué)方法，只能獲得生物的可培養(yǎng)部分，而這可培養(yǎng)部分僅占環(huán)境生物的百分之幾，不同的生物還需要準(zhǔn)備不同的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)[2]。用分子生態(tài)學(xué)研究方法可以更全面認(rèn)識(shí)環(huán)境中的生物，從環(huán)境中提取總的生物分子DNA，利用PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)，在特定引物作用下，將環(huán)境中存在的生物信息分子16S rDNA進(jìn)行2n倍擴(kuò)增（n=30～40），這些分子經(jīng)過連接到質(zhì)粒上轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)、選取連接轉(zhuǎn)換成功的細(xì)胞，并提取其中的生物信息分子16S rDNA，對其進(jìn)行測序，再與基因庫中的生物信息分子16S rDNA進(jìn)行對比，確定科屬或種屬，即構(gòu)建成環(huán)境樣品的基因文庫[3-7]。這種方法較費(fèi)時(shí)，但對研究環(huán)境中存在的物種非常有用。另一種簡便快速的生物技術(shù)方法是DGGE（變性梯度凝膠電泳），雖然得不到非常詳盡的物種信息，但可以快速檢測到生物的變化，對物種的部分信息也能有所了解。

本文用基因文庫法對兩個(gè)污水處理大站系統(tǒng)中的菌群進(jìn)行普查，建立江蘇油田回注污水的菌群基因組文庫，并應(yīng)用DGGE技術(shù)分析系統(tǒng)流程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，為后續(xù)污水治理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

高二聯(lián)和楊家壩污水處理站系統(tǒng)水樣；離心機(jī)；PCR擴(kuò)增儀；變性梯度凝膠電泳儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

總DNA提?。簩⒂吞锊杉臉悠窊u勻，取1200mL～2 000 mL樣品于離心杯中，5 000 r/min離心20 min，小心移除上清液。依次加入溶菌酶、氯仿處理，離心獲得樣品的總DNA。

PCR擴(kuò)增：所得細(xì)菌總DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA，瓊脂糖電泳檢測確認(rèn)，加入特征引物PCR擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)。

功能菌的選擇性培養(yǎng)：根據(jù)油田腐蝕重要菌的特性，利用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)腐生菌、鐵細(xì)菌及硫酸鹽還原菌，提取其總DNA擴(kuò)增16S rDNA中的V3區(qū)，同樣進(jìn)行DGGE分析，對照其他樣品，確定相關(guān)細(xì)菌，軟件測定各條帶亮度，分析總生物量和重要細(xì)菌的相對量。

2 結(jié)果與討論

2.1 油田水樣的DGGE測定結(jié)果

圖1 高二聯(lián)和楊家壩污水處理站系統(tǒng)中細(xì)菌群落及分類菌DGGE

對采集的高二聯(lián)和楊家壩區(qū)塊12個(gè)樣品，通過總DNA的提取，細(xì)菌群落的16S rDNA V3區(qū)選擇性擴(kuò)增，并進(jìn)行DGGE檢測，其結(jié)果（見圖1，左圖），并與選擇性培養(yǎng)后的結(jié)果對比（見圖1，右圖）。從圖1中可以看出各樣品呈現(xiàn)不同的細(xì)菌分布特征，主體微生物較接近。其中樣品3、4號(hào)細(xì)菌種類最豐富。3及4號(hào)合并建庫。

2.2 污水處理系統(tǒng)中細(xì)菌分布特征

根據(jù)水樣的細(xì)菌豐富情況，選擇3號(hào)和4號(hào)水樣合并構(gòu)建細(xì)菌文庫。由樣品的總DNA通過連接和轉(zhuǎn)化，構(gòu)建了相應(yīng)的文庫，結(jié)果（見表1）。

由表1可知，樣本中存在大量未培養(yǎng)的細(xì)菌，也存在 Geobacter lovleyi SZ，Desulfobulbus sp，Bacterium B1C2-1，Arcobacter sp.R-28214， 油田細(xì)菌，Pseudomonas stutzeri A1501，Bacteroides sp，Acholeplasma sp，Syntrophobacter sulfatireducens，Desulfobulbus propionicus，Desulforegula conservatrix，Wolinella succinogenes，F(xiàn)irmicutes bacterium 及 Trichlorobacter thiogenes等。主要的硫酸鹽還原菌為Desulfobulbus和Desulforegula。

表1 江蘇油田采集樣品3號(hào)和4號(hào)水樣的細(xì)菌文庫

表1 江蘇油田采集樣品3號(hào)和4號(hào)水樣的細(xì)菌文庫（續(xù)表）

其相對豐度（見表2）。

從表2可以看出，油田中以未培養(yǎng)的細(xì)菌為主，占總體的近40%，其次是羅氏地細(xì)菌和硫酸鹽還原菌分別約占16%，假單胞菌約占7%，端細(xì)菌及琥珀菌分別約占5%，其他如細(xì)菌，共生菌，三氯菌及鹽沼菌等各約占2%。根據(jù)油田功能菌（腐生菌、硫酸鹽還原菌及鐵細(xì)菌）分，腐生菌約占44%，硫酸鹽還原菌約占16%，鐵細(xì)菌＜2%，未培養(yǎng)其生理生化特性不明的微生物占40%。

根據(jù)文庫的細(xì)菌檢測到的豐度及DGGE條帶亮度的聯(lián)系，利用凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量，分析兩個(gè)污水處理系統(tǒng)中細(xì)菌量及群落變化或分布，結(jié)果（見表3，表 4）。

高集污水系統(tǒng)中油井微生物較多，處理后逐步降低，注水井中微生物又高了；假單胞菌油井中較多，處理后降低至消失；未培養(yǎng)菌及硫酸鹽還原菌為主體。油井中高6-58的硫酸鹽還原菌（細(xì)菌量指數(shù)1 203）較高6-65的硫酸鹽還原菌（細(xì)菌量指數(shù)700）高；地細(xì)菌油井中僅在高6-58存在，處理流程中逐步減少；端細(xì)菌在油井高6-65中較高，流程中僅在高二聯(lián)60 m3緩沖罐出口檢測到；沃氏琥珀菌僅在油井高6-58中檢測到；處理流程中高二聯(lián)三相分離器出口硫酸鹽還原菌（細(xì)菌量指數(shù)2 161）最高，依次減少緩沖罐出口硫酸鹽還原菌（細(xì)菌量指數(shù)1 337），高二聯(lián)注水泵進(jìn)口硫酸鹽還原菌（細(xì)菌量指數(shù)1 353）。

楊家壩污水處理系統(tǒng)中，處理流程中細(xì)菌量較高，隨處理過程而減少，種類較少，仍然以未培養(yǎng)菌及硫酸鹽還原菌為主體。該系統(tǒng)中，假單胞菌、地細(xì)菌、端細(xì)菌及沃氏琥珀菌幾乎沒有，僅在楊家壩注水泵進(jìn)口檢測到不足10%的地細(xì)菌。

油井中硫酸鹽不同，卞東中轉(zhuǎn)站硫酸鹽還原菌（細(xì)菌量指數(shù)3 598），郭塘中轉(zhuǎn)站硫酸鹽還原菌（細(xì)菌量指數(shù)1 544），閔18中轉(zhuǎn)站硫酸鹽還原菌（細(xì)菌量指數(shù)3 150），處理流程依次增加，楊三相分離器出口（硫酸鹽還原菌細(xì)菌量指數(shù)3 567），高100 m3沉降罐出口（硫酸鹽還原菌細(xì)菌量指數(shù)4 681），楊家壩注水泵進(jìn)口（硫酸鹽還原菌細(xì)菌量指數(shù)4 737）。

表2 檢測到的細(xì)菌相對豐度

表3 高集污水處理系統(tǒng)細(xì)菌群落分布

表4 楊家壩污水處理系統(tǒng)細(xì)菌群落分布

按油田功能分類細(xì)菌的結(jié)果（見表5）。

由表5可知，高集和楊家壩區(qū)塊污水中以腐生菌為主，其次是硫酸鹽還原菌，鐵細(xì)菌相對較少。值得注意的是，在卞東中轉(zhuǎn)站水樣中鐵細(xì)菌較多，硫酸鹽還原菌未檢測到；高6-65水樣中，鐵細(xì)菌較硫酸鹽還原菌多。

3 結(jié)論

（1）用基因文庫法對高二聯(lián)和楊家壩污水處理站系統(tǒng)中菌群進(jìn)行普查，建立了回注污水的菌群基因組文庫，發(fā)現(xiàn)水樣中以未培養(yǎng)的細(xì)菌為主，占總體的近40%，其次是羅氏地細(xì)菌和硫酸鹽還原菌分別約占16%，假單胞菌約占7%，端細(xì)菌及琥珀菌分別約占5%，其他如細(xì)菌，共生菌，三氯菌及鹽沼菌等各占約2%。根據(jù)油田功能菌（腐生菌、硫酸鹽還原菌及鐵細(xì)菌）分，腐生菌占約44%，硫酸鹽還原菌占約16%，鐵細(xì)菌占＜2%，未培養(yǎng)其生理生化特性不明的微生物占40%。

（2）通過DGGE分析發(fā)現(xiàn)，高二聯(lián)集輸系統(tǒng)中鐵細(xì)菌增加，而SRB減少。楊家壩集輸系統(tǒng)中，鐵細(xì)菌和SRB均增加。鐵細(xì)菌在高二聯(lián)集輸系統(tǒng)中比楊家壩集輸系統(tǒng)中多，而SRB在楊家壩集輸系統(tǒng)中比高二聯(lián)集輸系統(tǒng)多。

表5 油田水系統(tǒng)中分類菌的分布情況

（3）通過基因文庫法和DGGE技術(shù)對污水處理站系統(tǒng)中菌群分析，有利于了解污水處理系統(tǒng)中細(xì)菌種類和分布情況，特別是油田常見危害菌（SRB、TGB、FB）的分布，為后續(xù)治理細(xì)菌起到指導(dǎo)作用。