袁靈梅，賈洪亮，王燕，袁遠(yuǎn)，尚亞南，曾志奎，邱波

(1江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 330006；2廣東省中醫(yī)院；3解放軍第一五二中心醫(yī)院)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病(DM)最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，隨著DM患者人數(shù)的快速增長(zhǎng)和人口老齡化的加劇，其發(fā)病率逐步增加。DR是視網(wǎng)膜微血管長(zhǎng)期累積損傷的結(jié)果，氧化應(yīng)激是DR發(fā)病機(jī)制中的重要因素之一。研究表明，明目消朦(MMXM)對(duì)DR有效，包括單純期及增殖期DR。前期研究[1]表明，MMXM可抑制DM大鼠體內(nèi)的自由基毒素，改善體內(nèi)氧化-抗氧化平衡狀態(tài)，減少視網(wǎng)膜新生血管形成，而其對(duì)DR氧化應(yīng)激的影響有待進(jìn)一步探討。本研究通過(guò)H2O2制備人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE細(xì)胞)氧化應(yīng)激損傷模型，探討MMXM對(duì)RPE細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷的影響，旨在為MMXM治療DR的功能性作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器 MMXM(廣東省中醫(yī)院)，將2片(0.5 g/片)MMXM加入5 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中充分溶解，用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，將配置好的MMXM母液(200 mg/mL)放入4 ℃保存?zhèn)溆?。DMEM(美國(guó)Hyelon公司)，新生牛血清(美國(guó)Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，鏈霉素(廣州威佳科技有限公司)，青霉素(哈藥集團(tuán)制藥廠)，DMSO(廣州威佳科技有限公司)，30%過(guò)氧化氫(廣州化學(xué)試劑廠)，Muse Multicaspase Kit(Millipore)，Muse Oxidative stress Kit(Millipore)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-PX)試劑盒(南京建成)，其他分析純?cè)噭?廣州化學(xué)試劑廠)。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Heal Force)，純水儀(青島富勒姆科技)，流式細(xì)胞儀(Milipore)，渦旋混合器(Servicebio)，全自動(dòng)研磨儀(武漢康濤科技有限公司)，酶標(biāo)檢測(cè)儀(Rayto)，0.22 μm過(guò)濾器(廣州威佳科技有限公司)。

1.2 RPE細(xì)胞培養(yǎng) 獲取凍存的RPE細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。將恒溫水浴缸預(yù)熱至37 ℃，從液氮罐中取出凍存管，迅速放入37 ℃水浴中不斷輕搖凍存管使其完全融化。用75%酒精噴拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)用移液槍向凍存管內(nèi)加入完全培養(yǎng)基500 μL，500 r/min離心5 min。吸除上清液后加入完全培養(yǎng)基1 mL吹打重懸細(xì)胞。向準(zhǔn)備的培養(yǎng)皿內(nèi)加入完全培養(yǎng)基(細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%血清，鏈霉素100 μg/ mL，青霉素100 U/ mL的DMEM)，用移液槍將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)皿。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天細(xì)胞換液，之后2～3 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3 RPE細(xì)胞分組及MMXM應(yīng)用方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，按2×105/mL密度接種于含完全培養(yǎng)基的6 cm培養(yǎng)皿中，24 h細(xì)胞貼壁后，吸除舊培養(yǎng)基，更換無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為4組，A組加入含MMXM的無(wú)血清培養(yǎng)基，MMXM的終濃度為0.5 mg/mL，24 h后加入200 μmol/mL的H2O2(以制備氧化應(yīng)激損傷模型)；B組加入無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，24 h后加入200 μmol/mL的H2O2；C組加入含MMXM的無(wú)血清培養(yǎng)基，MMXM的終濃度為0.5 mg/mL；D組加入無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；4組細(xì)胞處理保持同步。24 h后同時(shí)取出4組細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化離心細(xì)胞，得到各組細(xì)胞沉淀。

1.4 RPE細(xì)胞凋亡率測(cè)算 預(yù)先按說(shuō)明書(shū)配制好調(diào)亡試劑(Multicaspase Reagent)。將Caspase Buffer 10×(100 μL)加900 μL的ddH2O稀釋至1×(1 000 μL)。細(xì)胞常規(guī)消化收集加入1×PBS 100 μL重懸細(xì)胞。將準(zhǔn)備好的4個(gè)1.5 mL離心管內(nèi)分別加入1×Caspase Buffer 50 μL和Multicaspase Reagent 5 μL后混勻。上述混勻液加入10 μL細(xì)胞懸液混勻。1.5 mL離心管避光條件下置于37 ℃孵育30 min。剩余的1×Caspase Buffer加入7-AAD原液5 μL配制成7-AAD工作液。離心管從37 ℃培養(yǎng)箱取出，在避光條件下各加入7-AAD工作液150 μL，避光室溫孵育5 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞調(diào)亡的結(jié)果，以調(diào)亡率來(lái)表示。

1.5 RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)檢測(cè) ①ROS檢測(cè):預(yù)先按說(shuō)明書(shū)配制好Oxidative stress工作液。細(xì)胞常規(guī)消化收集加入1×PBS 100 μL重懸細(xì)胞。取上述細(xì)胞懸液10 μL加入190 μL Oxidative stress工作液混勻。避光條件下置于37 ℃孵育30 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS結(jié)果。②MDA檢測(cè)：準(zhǔn)備4個(gè)離心管，標(biāo)準(zhǔn)管、空白管分別加入a*標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)水乙醇，測(cè)定管、對(duì)照管加入a*樣本，4個(gè)管同時(shí)加入a*的試劑一(a*表示所取的樣本量、無(wú)水乙醇、標(biāo)準(zhǔn)品量、試劑一的量，四者均相等)，標(biāo)準(zhǔn)管、空白管、測(cè)定管再加入3 mL試劑二和1 mL試劑三,對(duì)照管加入3 mL試劑二和1 mL 50%冰醋酸。加樣完成后用旋渦混勻器混勻，用保鮮薄膜將試管口扎緊，針頭在保鮮薄膜上刺一個(gè)小孔，95 ℃沸水反應(yīng)40 min，取出后用流水冷卻，然后3 500～4 000 r/min，離心10 min(3 000 r/min以下離心時(shí)間需延長(zhǎng)，目的使沉淀完全)。取上清，532 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度值。MDA含量(nmol/mg protein)=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)品濃度(10 nmol/mL)/樣品蛋白濃度(mg protein/mL)。③SOD檢測(cè)： 測(cè)定管和對(duì)照管各加入1 mL試劑一后分別加等量的樣品和蒸餾水，再加入0.1 mL試劑二、三、四，然后用旋渦混勻器充分混勻，37 ℃恒溫水浴40 min后加入2 mL顯色劑?；靹?，室溫放置10 min，于波長(zhǎng)550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色。SOD活力(U/mg protein)=(對(duì)照OD值-測(cè)定OD值)/對(duì)照OD值×0.5×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)/待測(cè)樣本蛋白濃度(mg protein/mL)。④GSH-PX檢測(cè)：測(cè)定管和對(duì)照管按說(shuō)明書(shū)流程加入試劑一、試劑二及樣品，混勻，3 500～4 000 r/min，離心10 min，取上清1 mL?？瞻坠芗覩SH標(biāo)準(zhǔn)品溶劑1 mL，標(biāo)準(zhǔn)管加20 μmol/L GSH標(biāo)準(zhǔn)液的1 mL，4個(gè)離心管同時(shí)加入試劑三、四、五，混勻，室溫靜置15 min后，412 nm處，1 cm光徑比色杯，雙蒸水調(diào)零，測(cè)各管OD值。GSH-PX活力=(非酶管OD值-酶管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(20 μmol/L)×稀釋倍數(shù)(5)/反應(yīng)時(shí)間/(取樣量×蛋白濃度)。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡率比較 A、B、C、D組細(xì)胞凋亡率分別為17.83%±1.71%、46.02%±2.34%、6.65%±0.88%、6.27%±0.97%，B組與其余3組比較，A、B組與C、D組比較，P均<0.05。

2.2 各組細(xì)胞ROS、MDA、SOD、GSH-P比較 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞ROS、MDA、SOD、GSH-P比較

注：與D組比較，△P<0.05；與B組比較，*P<0.05。

3 討論

DM是一種影響全身各個(gè)臟器和組織血管糖代謝紊亂的內(nèi)分泌性疾病。DR是DM的嚴(yán)重并發(fā)癥，為工作年齡段成人新發(fā)失明的主要原因。微血管瘤、淺層或深層出血、硬性滲出、棉絨斑、靜脈串珠樣、黃斑水腫等是DR的病變特點(diǎn)，后期隨著新生血管的出現(xiàn)，DR進(jìn)入增殖期。RPE細(xì)胞是視網(wǎng)膜光感受器的調(diào)節(jié)中起重要作用的視網(wǎng)膜細(xì)胞層，其在運(yùn)輸和儲(chǔ)存材料中起作用，例如吞噬分離的感光細(xì)胞外節(jié)，遮光，去除自由基，合成細(xì)胞因子，并形成血-視網(wǎng)膜屏障。故我們應(yīng)用DR發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用的RPE細(xì)胞[2～5]開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究，并通過(guò)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型。

DR治療相當(dāng)棘手，有效治療輕中度非增殖期DR的藥物尚少，而且適用于高危非增殖期及增殖期糖尿病視網(wǎng)膜患者的激光光凝可能損傷視網(wǎng)膜，抗VEGF治療費(fèi)用昂貴，且部分患者存在無(wú)應(yīng)答的情況。因此，找尋有效、價(jià)格適中且不良反應(yīng)少的治療方法是亟待解決的問(wèn)題。中醫(yī)藥治療DR的研究取得了一定進(jìn)展，不少研究結(jié)果證明DR應(yīng)用中醫(yī)藥治療具有良好的前景[6～9]。MMXM主要由蒺藜、五味子、密蒙花等中藥組成。蒺藜含有類(lèi)固醇、皂甙、類(lèi)黃酮等天然動(dòng)態(tài)物質(zhì)，蒺藜提取物具有抗氧化和清除自由基的特性；類(lèi)黃酮是一種抗氧化劑，可以降低ROS[10]。文獻(xiàn)[11,12]報(bào)道，五味子亦具有強(qiáng)大的抗氧化功效。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，DR以氣陰兩虛為本虛，瘀血阻絡(luò)為標(biāo)實(shí)。故中醫(yī)治療DR多從益氣養(yǎng)陰補(bǔ)其虛，活血通絡(luò)、化痰散瘀治其標(biāo)。MMXM具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、化痰、明目的功能。方中補(bǔ)瀉兼施，寒溫并用，補(bǔ)中有瀉，寒中有熱。全方合用諸藥，既能針對(duì)DM的陰虛之本，又能兼顧早期的氣陰兩虛之特點(diǎn)既能針對(duì)瘀血、痰濕等實(shí)證之標(biāo)，又能涼血止血而不留瘀血、化痰散結(jié)不傷正。MMXM在治療眼底病方面能改善視網(wǎng)膜微循環(huán)障礙，改善視網(wǎng)膜的缺血缺氧狀態(tài)，從而促進(jìn)視網(wǎng)膜滲出、出血的吸收，對(duì)改善氣陰兩虛、痰瘀互結(jié)的中醫(yī)證候療效滿意。

氧化應(yīng)激是DR的重要機(jī)制，可直接導(dǎo)致DM視網(wǎng)膜細(xì)胞功能障礙或細(xì)胞凋亡[13～15]。氧化應(yīng)激可能由于代謝應(yīng)激的持續(xù)循環(huán)，組織損傷和細(xì)胞死亡而被放大，導(dǎo)致自由基產(chǎn)生增加并且損害了自由基抑制性清除劑系統(tǒng)，而這又進(jìn)一步加劇了氧化應(yīng)激。研究指出，DM并發(fā)癥的所有機(jī)制似乎都與活性ROS過(guò)量產(chǎn)生有關(guān)[16]。ROS與脂質(zhì)的特定反應(yīng)通常稱(chēng)為“脂質(zhì)過(guò)氧化”，脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程的主要產(chǎn)物是MDA[17,18]。本研究顯示，與B組比較，其余3組細(xì)胞凋亡率降低；與C、D組比較，A、B組細(xì)胞凋亡率升高。與D組比較，A、B組ROS(+)、MDA升高，ROS(-)降低；與B組比較，其余3組ROS(-)升高，ROS(+)、MDA降低。人體自身配備了一個(gè)高效的抗氧化防御系統(tǒng)，其中包括多種抗氧化酶，抗氧化物被認(rèn)為是檢測(cè)自由基并防止它們對(duì)其他細(xì)胞造成損害的第一道防線[19]。SOD是一種內(nèi)源性的抗氧化劑，幾乎所有的細(xì)胞中都存在SOD。GSH是一種胞內(nèi)抗氧化劑，在細(xì)胞中重要的防御,它可以充當(dāng)ROS清除劑和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)[20]。GSH-PX在DM患者中喪失其活性和抗原性，谷胱甘肽氧化還原反應(yīng)，生物合成和降解受到影響。本研究顯示，與D組比較，A、B組SOD、GSH-PX降低；與B組比較，其余3組SOD、GSH-PX升高。當(dāng)抗氧化酶和抗氧化物消耗時(shí)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞損傷[21]。

總之，MMXM能有效減少H2O2介導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡，并可預(yù)防細(xì)胞氧化損傷。