韋尉元，陳建思，覃宇周，莫顯偉，嚴(yán)林海，肖強(qiáng),2

(1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021；2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

胃癌是常見的消化道腫瘤之一，在中國(guó)、日本和韓國(guó)等地區(qū)仍維持較高的發(fā)病率，目前我國(guó)每年新發(fā)病例超過47萬例，病死率為33.93/10萬，嚴(yán)重危害人民健康和生命。臨床上主要采用手術(shù)、化療和放療等綜合手段治療胃癌，而對(duì)于中晚期胃癌，隨著病情發(fā)展，會(huì)出現(xiàn)手術(shù)禁忌、化療耐藥、放療不敏感，使上述方法控制胃癌進(jìn)展的效果非常有限，最終避免不了發(fā)生轉(zhuǎn)移，其發(fā)生機(jī)制與多種基因突變和信號(hào)通路調(diào)控異常密切相關(guān)[1,2]。近年來，阻斷劑干預(yù)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而達(dá)到抑制腫瘤增殖生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移的效果，為腫瘤的防治提供了新的治療途徑[3]。前期研究表明，微小RNA1284(miR-1284)過表達(dá)靶向下調(diào)真核翻譯起始因子4A1(EIF4A1)表達(dá)，發(fā)揮抑制胃癌侵襲、遷移和增加化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用[4]，提示EIF4A1可能與胃癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。文獻(xiàn)[5]報(bào)道，EIF4A1可被Silvestrol結(jié)合，從而抑制EIF4A1的活性。但EIF4A1及其藥物抑制劑Silvestrol在胃癌中的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究采用免疫組化法檢測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性或陰性胃癌患者腫瘤組織EIF4A1，分析其與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性；另通過Silvestrol干擾人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、存活、侵襲、遷移能力的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 選擇2013～2015年廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院留存的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、陰性胃癌組織標(biāo)本各20例份，另取匹配的癌旁(距癌組織4 cm)正常組織各20例份，標(biāo)本直徑均為0.5 cm，以10%的甲醛固定。所有胃癌標(biāo)本均經(jīng)過病理診斷確認(rèn)，且患者均簽訂知情同意書。

1.2 細(xì)胞、主要試劑及抑制劑 SGC-7901細(xì)胞；EIF4A1，蛋白激酶B(AKT)，GAPDH基因兔抗人抗體，羊抗兔二抗IgG抗體，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴(kuò)增試劑盒，即用型SP免疫組化試劑盒，Silvestrol。

1.3 胃癌組織EIF4A1檢測(cè) 采用免疫組化法。切取4 μm厚的切片，貼于防脫玻片上，64 ℃烤片3 h。常規(guī)脫蠟、修復(fù)、封閉，滴加1∶300比例的一抗EIF4A1稀釋工作液，在37 ℃孵育1～2 h(或4 ℃濕盒內(nèi)過夜)，用PBS緩沖液代替一抗做陰性對(duì)照，孵育過夜，PBS沖洗3次。滴加1∶500比例的生物素標(biāo)記二抗稀釋工作液孵育。加DAB溶液顯色液，顯微鏡下觀察顯色。蒸餾水洗滌以終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來水浸泡藍(lán)化。脫水、透明及封片。根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度確定基因表達(dá)程度，兩種評(píng)分相加所得的總分值即為最后的評(píng)分結(jié)果，同一患者的胃癌組織和匹配癌旁正常組織的進(jìn)行總分值比較，如兩者分值不一樣，得分高者為高表達(dá)，得分低者為低表達(dá)；如兩者總分值一樣，且分值≤3分，兩者都評(píng)定為低表達(dá)；如兩者總分值一樣，且分值>3分，兩者都評(píng)定為高表達(dá)。

1.4 SGC-7901細(xì)胞增殖活性檢測(cè)、活細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)測(cè)算、遷移距離測(cè)量 ①SGC-7901細(xì)胞增殖活性：采用CCK-8法。使用RPMI1640(含10%胎牛血清)培養(yǎng)液，將SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，常規(guī)胰酶消化細(xì)胞，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至3 000個(gè)/100 μL。以每孔100 μL接種于96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，藥物組加含120 μg/mL的Silvestrol(在DMSO溶劑溶解)細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL，模型組加含0.5%DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL，對(duì)照組加細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL。置于恒溫培養(yǎng)箱中(37 ℃、5%CO2)，孵育常規(guī)培養(yǎng)。48 h后吸凈孔中原培養(yǎng)液，加無血清培養(yǎng)基90 μL，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在孵育箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h后，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度值(OD值)，各組細(xì)胞增殖能力以O(shè)D值表示。②SGC-7901細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)：采用Countess Ⅱ FL細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。按“①”方法將培養(yǎng)細(xì)胞分組并進(jìn)行干預(yù)，48 h后常規(guī)胰酶消化各孔細(xì)胞，離心，把各孔細(xì)胞總液體體積調(diào)為1 mL，充分吹打均勻，取其中的10 μL細(xì)胞懸液加到已含10 μL的臺(tái)酚藍(lán)PCR管中，充分吹打均勻，取其中10 μL加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，Countess Ⅱ FL細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)各組活細(xì)胞數(shù)。③SGC-7901細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)測(cè)算：采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。取Corning小室(孔徑8 μm)，在小室濾膜上鋪一層Matrigel(用無血清培養(yǎng)液1∶4稀釋，75 μL/孔，37 ℃溫育30 min，形成膠狀)。按“①”方法將培養(yǎng)細(xì)胞分組并進(jìn)行干預(yù)，48 h后常規(guī)胰酶消化各孔細(xì)胞，離心，各組細(xì)胞用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至6×105個(gè)/100 μL。在上室孔中加入各組細(xì)胞懸液100 μL(6×105/孔，無血清培養(yǎng)基的單細(xì)胞懸液)。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。下室中加入含10%血清的培養(yǎng)液600 μL，培養(yǎng)24 h后用冰預(yù)冷的甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色15～20 min，用PBS洗3遍以上，顯微鏡100倍下拍照。隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算平均每個(gè)視野侵襲細(xì)胞數(shù)，各組細(xì)胞侵襲能力以侵襲細(xì)胞數(shù)表示。④SGC-7901細(xì)胞遷移距離測(cè)量：采用劃痕實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至6×105個(gè)/100 μL，以6×105個(gè)/孔分別相應(yīng)的接種到6孔板中，藥物組加含120 μg/mL Silvestrol的培養(yǎng)液100 μL和含60 μg/mL Silvestrol的培養(yǎng)液1 000 μL，模型組加含0.5%DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL和含0.25%DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液1 000 μL，對(duì)照組加細(xì)胞培養(yǎng)液1 100 μL，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃孵育24 h，用200 μL移液器槍頭于培養(yǎng)板底部劃“一”形痕，PBS沖洗2遍，徹底洗脫懸浮細(xì)胞，分別于培養(yǎng)至48 h，應(yīng)用相差顯微鏡拍攝劃痕邊緣進(jìn)展情況，NIH圖像處理軟件分析細(xì)胞遷移程度，以48 h后各組細(xì)胞劃痕邊緣的兩邊平均距離表示細(xì)胞遷移能力, 劃痕邊緣距離越大，遷移能力越弱。

1.5 SGC-7901細(xì)胞EIF4A1和AKT mRNA、蛋白檢測(cè) ①EIF4A1、AKT mRNA檢測(cè)：采用qRT-PCR法。按“1.4中①方法”將培養(yǎng)細(xì)胞分組并進(jìn)行干預(yù)，48 h后常規(guī)胰酶消化各孔細(xì)胞，離心，收集各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA并檢測(cè)RNA的純度及濃度。逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)均嚴(yán)格按照TaKaRa公司提供的說明書，以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量，每組設(shè)3復(fù)孔，在Roche實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以相對(duì)表達(dá)量表示EIF4A1、AKT mRNA表達(dá)情況。②細(xì)胞EIF4A1、AKT蛋白檢測(cè)：采用Western blotting法。按“1.4中①方法”將培養(yǎng)細(xì)胞分組并進(jìn)行干預(yù)，48 h后常規(guī)胰酶消化各孔細(xì)胞，離心，收集各組細(xì)胞，按照蛋白提取試劑盒說明提取各組細(xì)胞的總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白含量。取150～250 μg蛋白在10%SDS-PAGE膠上電泳，后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，用一抗稀釋液分別加入兔抗人EIF4A1、AKT、GAPDH基因抗體，于4 ℃孵育過夜；用TBST洗滌膜5次，再加入羊抗兔抗體IgG(1∶12 000)，常溫孵育30 min，膠片曝光顯影，GAPDH為內(nèi)參照，以EIF4A1、AKT的條帶灰度值相對(duì)表達(dá)量表示EIF4A1、AKT的蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 胃癌、癌旁正常組織中EIF4A1表達(dá)比較 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性胃癌組織及癌旁正常組織中EIF4A1高表達(dá)分別為17例(85.0%)、3例(15.0%)，兩者比較，P<0.05；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性胃癌組織及癌旁正常組織中EIF4A1高表達(dá)分別為11例(55.0%)、9例(45.0%)，兩者比較，P﹥0.05。

2.2 各組細(xì)胞OD值及活細(xì)胞數(shù)比較 結(jié)果見表1。由表1可知，各組OD值及活細(xì)胞數(shù)兩兩比較，P均>0.05。

表1 各組細(xì)胞OD值及活細(xì)胞數(shù)

2.3 各組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移距離比較 結(jié)果見表2。

表2 各組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移距離比較

注：與其余兩組比較，*P<0.05。

2.4 各組EIF4A1和AKT蛋白、mRNA表達(dá)比較 結(jié)果見表3。

表3 各組EIF4A1和AKT蛋白、mRNA表達(dá)比較

注：與其余兩組比較，*P<0.05。

3 討論

胃癌是最常見的消化道腫瘤之一，盡管發(fā)病率在全球呈下降趨勢(shì)，但在中國(guó)、日本和韓國(guó)等地區(qū)仍較高，胃癌組織細(xì)胞學(xué)分類較多，其中SGC-7901細(xì)胞是胃癌的一種細(xì)胞類型，于1979年建系，源自一位56歲女性胃腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，使用含10%的胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)，SGC-7901細(xì)胞在免疫抑制的小鼠皮下及腹腔可移植成功，是被研究者廣泛應(yīng)用的一種細(xì)胞模型。

EIF4A1是真核翻譯起始因子4A(EIF4A)家族的重要成員之一，EIF4A解旋酶家族成員在序列上存在高度同源，哺乳動(dòng)物中存在EIF4A1、EIF4A2、EIF4A3共3種EIF4A形式，人類EIF4A1和EIF4A2屬于胞質(zhì)蛋白，兩者的同源性較高，EIF4A3蛋白主要定位在核內(nèi)，與EIF4A1的同源性較低，其發(fā)揮作用需與多種真核翻譯起始因子蛋白結(jié)合[6]。同時(shí)研究[7]表明，在不同細(xì)胞狀態(tài)下，EIF4A1和EIF4A2表達(dá)不同，EIF4A1在生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞中高表達(dá)，而EIF4A2在生長(zhǎng)停滯的細(xì)胞中高表達(dá)，敲除EIF4A1可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，敲除EIF4A2不能影響細(xì)胞生長(zhǎng)，提示EIF4A1被激活是促進(jìn)蛋白翻譯，可能加速腫瘤細(xì)胞惡性生長(zhǎng)發(fā)揮重要作用。前期我們研究也表明，miR-1284過表達(dá)可下調(diào)EIF4A1基因表達(dá)而發(fā)揮抑制胃癌侵襲遷移[4]，提示EIF4A1可能與胃癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)；同時(shí)研究[5]報(bào)道，EIF4A1可被來自植物的提取的藥物Silvestrol結(jié)合，從而抑制EIF4A1基因的活性，因此探討EIF4A1在胃癌中表達(dá)及其抑制劑的作用可為胃癌的研究提供重要的科學(xué)理論。本研究顯示，EIF4A1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的胃癌組織中表達(dá)量高于癌旁正常組織，而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)無差異，提示EIF4A1高表達(dá)可能有助于胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

文獻(xiàn)[8]報(bào)道，敲除EIF4A1可降低AKT、ERKs蛋白的表達(dá)及活性；同時(shí)也有研究表明，AKT可激活mTOR(哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白)的表達(dá)，而啟動(dòng)mTOR信號(hào)通路調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞Jagged1蛋白重新恢復(fù)表達(dá)，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞生成[9,10]，血管是保障腫瘤營(yíng)養(yǎng)的重要渠道，臨床上通過介入治療阻塞血管達(dá)到控制腫瘤效果。同時(shí)，Jagged1是Notch受體其中的一個(gè)主要配體，通過與鄰近細(xì)胞表面Notch受體結(jié)合，啟動(dòng)Notch信號(hào)通路。Notch1信號(hào)通路激活可直接或間接調(diào)控下游基因DEPTOR、c-Myc促進(jìn)T細(xì)胞白血病細(xì)胞增殖和存活[11,12]。研究[13]也表明，抑制Notch1表達(dá)可以降低胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖能力，減少胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。有研究[14]證實(shí)，在進(jìn)展期乳腺癌和前列腺癌中AKT可通過E-鈣黏蛋白CDH1而調(diào)控Skp2的表達(dá)，而JUN積聚程度依賴于激活型CDH1在細(xì)胞間粘合作用效果，JUN表達(dá)下調(diào)可抑制VEGF和MMP蛋白表達(dá)，下調(diào)MMP和VEGF的表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞侵襲和遷移[15]。我們前期研究[16,17]也發(fā)現(xiàn)，Jagged1、Notch1、c-Myc、CDH1基因與胃癌細(xì)胞增殖、存活、遷移和侵襲密切相關(guān)。本研究顯示，與模型組、對(duì)照組比較，藥物組侵襲細(xì)胞數(shù)少，細(xì)胞遷移距離長(zhǎng)，EIF4A1和AKT蛋白、mRNA表達(dá)降低。提示Silvestrol可抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲、遷移能力，其機(jī)制可能與降低EIF4A1、AKT表達(dá)有關(guān)。