楊 琨，李 駿，豐奇昊，沈夢杰，陳謙謙，羅雅馨，劉 琪，溫秀杰

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 牙周科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 種植科，貴州 遵義 563099；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院 口腔科，重慶 400000)

顱神經(jīng)嵴(cranial neural crest，CNC)來源的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞(ecto-mesenchymal stem cell)，是除牙釉質(zhì)以外所有牙齒組織的形成細(xì)胞[1]。在牙齒的發(fā)育過程中，這些細(xì)胞遷移至上下頜突，與牙源性上皮相互作用形成牙囊和牙乳頭，進(jìn)而分化為多種牙齒組織發(fā)生細(xì)胞，經(jīng)過一系列的分化機(jī)制，形成牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)等組織[2]。來源于顱神經(jīng)嵴的EMSCs在頜面部及牙齒的發(fā)生發(fā)育過程中起到非常重要作用。而EMSCs的增殖及遷移能力以及上皮—間充質(zhì)的相互作用是目前牙發(fā)育研究乃至牙組織工程研究所關(guān)注的重點(diǎn)。

MAGE-D1同樣稱為NRAGE或者Dlxin-1，屬于MAGE家族蛋白[3-4]。一共有32個MAGE家族的蛋白被檢測出，但是這個家族正常生理學(xué)功能仍然不清楚[5]。hMAGE-A、hMAGE-B和hMAGE-C等亞家族成員只表達(dá)在男性精子細(xì)胞及胎盤中[5]，在許多正常組織中屬于緘默基因[3,5]。然而許多MAGE家族成員表達(dá)在多種腫瘤細(xì)胞中，因此對其抗腫瘤免疫治療引起了特殊的興趣[5]。hMAGE-D亞家族在許多正常組織及處于不同的表達(dá)水平[3,6-7]。mMAGE-D1主要表達(dá)在鼠科動物大腦及卵巢中[8]，表明MAGE-D1在雌性生育組織中起到非常重要的作用。前期研究表明，MAGE-D1是細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞黏附及血管生成的調(diào)控因子[3-4,9-10]。目前大量的研究都表明，MAGE-D1在胸腺癌細(xì)胞[11]、胰腺癌細(xì)胞[12]、黑色素瘤細(xì)胞[13]及食管癌細(xì)胞[14]中的增殖遷移及侵襲生物學(xué)過程中存在非常重要的作用，但是我們感興趣的是，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化這一牙發(fā)育的基本過程可能也受到MAGE-D1的調(diào)控，特別是顱神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠參與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，并且進(jìn)一步影響牙及頜面部組織的發(fā)育。我們已經(jīng)證明在大鼠的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞中，MAGE-D1能與p75NTR結(jié)合從而影響細(xì)胞的骨向分化能力[15]，但在此過程中，外胚間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化的影響是否會是MAGE-D1干預(yù)的細(xì)胞增殖遷移能力改變的作用？是本研究著重解決的問題。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 DMEM-F12培養(yǎng)基、胰酶(Gibco,美國)；胎牛血清(Gibco，美國)；鼠抗人CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、CD105、CD146、CD166、p75NTR單克隆抗體(Abcam,美國)；MAGE-D1單克隆抗體(Bioworld，美國)；細(xì)胞RNA提取試劑盒、Real Time-PCR mix試劑盒(Takara，日本)；細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(Beyotime，上海)；β-catenin鼠單克隆抗體，E-cadherin鼠單克隆抗體，GAPDH鼠單克隆抗體，山羊抗兔lgG(Abcam，美國)；羅丹明山羊抗小鼠IgG(中杉金橋，北京)；MAGE-D1 siRNA引物(Sangon，上海)；lipofectamine 2000(Thermo Fisher，美國)。

體式顯微鏡、倒置相差顯微鏡以及照相系統(tǒng)(OLYMPUS，日本)；流式細(xì)胞分析儀(Beckmen Coulter，MoFloAstriosEQ美國)；Real Time PCR儀器(Applied Biosystems,7500 FastDX美國)。

1.2 大鼠E19.5 d牙胚來源外胚間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定 SD大鼠胚胎19.5 d頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞(E19.5d EMSCs)：在大鼠孕E19.5 d午間以40 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥鈉，取出數(shù)個胚胎，置入6 cm培養(yǎng)皿，剝離羊膜后頭身分離，后分離上下頜，于體式顯微鏡下固定點(diǎn)位，剝開軟骨組織，眼科鑷取出牙胚組織，置入裝有5 mL PBS的15 mL離心管，搖晃清洗后離心，加入1 mL1%Ⅰ型膠原酶置入孵箱內(nèi)消化30 min，中和離心1 000 rpm，3 min，去上清后將組織均勻平鋪于6 cm培養(yǎng)皿中，加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液約4～5 mL，置于含5%CO2的恒溫箱中靜置貼壁培養(yǎng)，37 ℃，約24 h后顯微鏡下可見細(xì)胞從組織塊中爬出并貼壁生長。

取生長狀態(tài)良好的第3代E19.5d EMSCs，常規(guī)消化離心后，稀釋并計數(shù)，細(xì)胞數(shù)量為5×105個/1.5 mL EP管，加入已配制好的含3% FBS的PBS重懸細(xì)胞，加入CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、CD105、CD146、CD166和p75NTR單克隆抗體2 μL，4 ℃冰箱避光孵育12 h(過夜)，12 000 rpm 離心5 min，加入單抗相對應(yīng)的熒光二抗避光孵育2 h，無需熒光的加入等量PBS。加入含3%FBS的PBS混合均勻溶液，吹勻，3% FBS 的PBS清洗，12 000 rpm離心5 min，清洗2～3次后加300 μL 3% FBS 的PBS，重懸，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞表面分子。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.3 MAGE-D1siRNA轉(zhuǎn)染 取第3代，E19.5d EMSCs 5×104個細(xì)胞接種在24孔板上，待24 h后匯集率至70%～90%，0.5 mL 10%FBS DMEM-F12和抗生素的DMEM(或Opti-MEM，其他培養(yǎng)基)細(xì)胞培養(yǎng)基更換繼續(xù)培養(yǎng)12 h?；靹騦ipofectamine2000試劑，用50 μL無血清的DMEM稀釋1 μL lipofectamine試劑輕輕混勻，室溫放置5 min；將稀釋好的siRNA和RNAi-Mate試劑混合；輕柔混勻，室溫放置20 min，以便形成siRNA/lipofectamine復(fù)合物，加入孔板中，孵育12 h后，除去復(fù)合物，更換新鮮的10%FBS DMEM-F12培養(yǎng)基，Real-Time PCR檢測轉(zhuǎn)染效果(圖4 A)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得后進(jìn)行下一步實(shí)驗。

后續(xù)實(shí)驗的細(xì)胞分為兩組：對照組(Control)和MAGE-D1 siRNA組(MAGE siRNA-EMSCs)，其中對照組為E19.5 d牙胚來源外胚間充質(zhì)干細(xì)胞，MAGE-D1 siRNA組為MAGE-D1siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(MAGE siRNA-EMSCs)。

1.4 CCK8檢測兩組細(xì)胞增殖能力變化 分別取生長狀態(tài)良好的第3代E19.5d EMSCs及MAGE siRNA-EMSCs，按細(xì)胞密度為1×103個/孔接種，測7d增殖曲線，每天作5個復(fù)孔，每孔細(xì)胞培養(yǎng)基為200 μL含 10%FBS 的DMEM-F12。24 h后，第1天各組細(xì)胞加入20 μL CCK8，反應(yīng)1 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光度值，檢測7 d，繪制兩組細(xì)胞連續(xù)生長曲線。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.5 劃痕實(shí)驗法檢測兩組細(xì)胞遷移能力的變化 用Marker筆在6孔板背側(cè)劃線，1 cm一道橫向標(biāo)記，第3代E19.5 d EMSCs和MAGE siRNA-EMSCs調(diào)整細(xì)胞密度后鋪板，用200 μL槍頭垂直背側(cè)橫向標(biāo)記劃痕，置于37 ℃，5%CO2，飽和濕度孵箱，于0、72、120 h后照相。每個視野用imageJ軟件做出6條橫線測量橫線間最近兩個細(xì)胞的距離，其平均值為72～120 h中48 h時間的各組細(xì)胞的遷移量。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.6 Real Time-PCR檢測兩組細(xì)胞MAGE-D1、β-catenin、E-cadherin的mRNA表達(dá) 對照組和MAGEsiRNA-EMSCs組細(xì)胞培養(yǎng)3 d后進(jìn)行細(xì)胞收集，按TRIzol說明書方法提取EMSCs總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。參照GenBank數(shù)據(jù)庫，基因號分別為：MAGE-D1(ID:84469)、β-catenin(ID:84353)、E-cadherin(ID:83502)、GAPDH(ID:24383)，以Primer primer 5.0計算機(jī)軟件設(shè)計引物；以GAPDH為內(nèi)參照，反應(yīng)體系：premix 10 μL、dye 0.4 μL、ddH2O 6.6 μL、上下游引物各0.5 μL、樣本模板2 μL；反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min、 94 ℃ 30 s 、65 ℃ 30 s、40個循環(huán)。實(shí)驗重復(fù)3次，所用引物均由上海生工公司合成，各引物基因序列見表1。

表1引物基因序列

基因引物序列GAPDH正向:5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'反向:5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'MAGE-D1正向:5'-GCCAGATACCACCAGAATGC-3'反向:5'-TCAACCCAGAAGAAGCCAAT-3'β-catenin正向:5'-GCTGACCAAACTGCTAAATGACGA-3'反向:5'-TGTAGGGTCCCAGCGGTACAA-3' E-cadherin正向:5'-AGCCAGACACATTCATGGAAC-3'反向:5'-TCGTTATCCGAGATTGAGA-3'

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測兩組細(xì)胞MAGE-D1、β-catenin、E-cadherin蛋白水平 取培養(yǎng)3 d后的對照組和MAGEsiRNA-EMSCs組細(xì)胞，用碧云天Western及IP細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提??；用碧云天BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量測定；SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，免疫反應(yīng)；最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 E19.5d外胚間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng) 通過組織塊法及膠原酶消化法成功獲得并培養(yǎng)了E19.5d胚胎時期牙胚來源外胚間充質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，為間充質(zhì)干細(xì)胞紡錘樣形態(tài)，呈梭形或多邊形(見圖1)。

A：E19.5d原代EMSCs；B：E19.5d第三代EMSCs。圖1 E19.5d外胚間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

2.2 E19.5d外胚間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定 通過流式細(xì)胞儀檢測E19.5d外胚間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子，細(xì)胞陽性表達(dá)的結(jié)果分別為：CD14(92.16%)、CD29(94.53%)、CD44(99.51%)、CD90(95.18%)、CD105(34.22%)、CD146(92.39%)、CD166(98.15%)和p75NTR(88.56%)，細(xì)胞陰性表達(dá)CD45(0.50%)。

2.3 大鼠EMSCs與MAGE siRNA-EMSCs增殖能力 比較兩組細(xì)胞7 d增殖曲線，在對照組和MAGEsiRNA-EMSCs組相同培養(yǎng)條件下，對照組增殖能力高于MAGEsiRNA-EMSCs組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖2)。

圖2 CCK8檢測對照組和MAGEsiRNA-EMSCs組細(xì)胞增殖能力

2.4 大鼠EMSCs與MAGE siRNA-EMSCs遷移能力 比較劃痕實(shí)驗72 h后，兩組細(xì)胞都發(fā)生遷移，但是MAGEsiRNA-EMSCs組(D)遷移能力較對照組(C)強(qiáng)，至120 h時仍能發(fā)現(xiàn)相同情況，計算72～120 h間48 h時間的細(xì)胞遷移量平均值，MAGEsiRNA-EMSCs組明顯多于對照組(P<0.0001)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖3)。

A：0 h對照組；B:MAGEsiRNA-EMSCs組0 h；C：72 h對照組；D:MAGEsiRNA-EMSCs組72 h；E：120 h對照組；F:MAGEsiRNA-EMSCs組120 h；G:兩組細(xì)胞在72～120 h間48 h的細(xì)胞遷移量統(tǒng)計圖(***：P<0.000 1)。圖3 劃痕實(shí)驗法檢測對照組和MAGEsiRNA-EMSCs組EMSCs遷移能力

2.5 大鼠牙胚來源外胚間充質(zhì)干細(xì)胞MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin的mRNA表達(dá) 對照組MAGE-D1表達(dá)明顯高于MAGEsiRNA-EMSCs組(P<0.01)。為深入比較兩組細(xì)胞遷移能力變化的機(jī)制，檢測β-catenin,E-cadherin的mRNA表達(dá)，對照組E-cadherin表達(dá)明顯高于MAGEsiRNA-EMSCs組(P<0.05)，β-catenin表達(dá)趨勢與E-cadherin相反(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖4)。

A:MAGE-D1；B:E-cadherin；C:β-catenin。*：P<0.05；**：P<0.01。圖4 兩組細(xì)胞的MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin的mRNA表達(dá)

2.6 大鼠牙胚來源外胚間充質(zhì)干細(xì)胞MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin的蛋白水平 培養(yǎng)3 d后的對照組和MAGE siRNA-EMSCs組細(xì)胞，兩組細(xì)胞MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin蛋白表達(dá)的變化趨勢與其mRNA表達(dá)變化結(jié)果相一致(見圖5)。

圖5 兩組細(xì)胞的MAGE-D1、β-catenin和E-cadherin的蛋白水平

3 討論

神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞在牙發(fā)育形態(tài)形成中存在非常重要的作用。Abe等[16]自人阻生齒未成熟的根尖中獲得神經(jīng)嵴來源的根髓干細(xì)胞群。Karbalaie等[17]利用人胚胎干細(xì)胞 (human embryonic stem cells，hESCs) 與人乳牙間充質(zhì)干細(xì)胞 (stromal stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED) 共同培養(yǎng)，獲得神經(jīng)嵴來源的細(xì)胞。這些結(jié)果都表明，在牙和頜面部發(fā)育及形成的過程中，神經(jīng)嵴來源的干細(xì)胞在其中扮演的重要角色，因此，我們培養(yǎng)擴(kuò)增E19.5 d牙胚來源的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞作為主要研究對象，以此討論牙發(fā)育過程中關(guān)鍵步驟：上皮—間充質(zhì)相互轉(zhuǎn)化的可能機(jī)制。

在本課題組的前期研究中[18-19]，我們建立了能夠代表神經(jīng)嵴來源干細(xì)胞的細(xì)胞模型，通過流式細(xì)胞表面分子鑒定我們也發(fā)現(xiàn)，此牙胚來源的細(xì)胞高表達(dá)包括p75NTR[15]在內(nèi)的神經(jīng)嵴源性及間充質(zhì)源性的細(xì)胞表面標(biāo)志性分子。本研究培養(yǎng)出的細(xì)胞形態(tài)觀察也可以發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞呈紡錘狀或多邊形狀，具有間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)。神經(jīng)嵴來源的EMSCs可以代表胚胎發(fā)育一個時期的始祖細(xì)胞，研究其參與牙及胚胎發(fā)育中的增殖、遷移等作用機(jī)制是頜面部及牙發(fā)育組織工程的一個重點(diǎn)。

MAGE-D1能與多種胞內(nèi)胞外蛋白結(jié)合并且介導(dǎo)并調(diào)控諸如凋亡[20]、轉(zhuǎn)錄[21]、細(xì)胞周期[22]、細(xì)胞黏附及血管化[11]等細(xì)胞生理功能。本研究中我們首次討論MAGE-D1轉(zhuǎn)染對外胚間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移的影響。近年來有大量的證據(jù)表明MAGE-D1具有抑制增殖的能力。體外實(shí)驗HEK293腎上皮細(xì)胞系中，MAGE-D1展示出顯著的抑制增殖的能力，還包括肝癌HepG2細(xì)胞以及人骨肉瘤細(xì)胞U2OS[23]。MAGE-D1同樣能夠與其有同源結(jié)構(gòu)域蛋白necdin反應(yīng)，necdin是一個潛在的生長抑制因子，并且廣泛的表達(dá)在有絲分裂后期細(xì)胞包括神經(jīng)元和骨骼肌細(xì)胞，兩者結(jié)合能夠誘導(dǎo)生長停滯[24]。Wen等[23]發(fā)現(xiàn)MAGED1通過p53依賴通路抑制HEK203、U2OS及HepG2細(xì)胞生長。細(xì)胞周期停止發(fā)生在G2/M及G1期。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)MAGE-D1在交感神經(jīng)前體細(xì)胞中通過結(jié)合p75NTR介導(dǎo)G1期停滯[25]。國外研究報道MAGE-D1能夠通過JNK/C-JUN通路誘導(dǎo)caspase激活以及細(xì)胞死亡[26]。也有研究發(fā)現(xiàn)MAGE-D1并不能誘導(dǎo)HEK203,U2OS及HepG2的凋亡[23]。唯一合理的解釋是：MAGE-D1在不同的細(xì)胞中存在不一樣的功能。大多數(shù)的研究都集中在腫瘤細(xì)胞的研究中，而本研究突破以往理念的束縛，在外胚間充質(zhì)干細(xì)胞中調(diào)控MAGE-D1，觀察其對細(xì)胞生理過程產(chǎn)生的影響，而從增殖及劃痕實(shí)驗來看，雖然人為下調(diào)MAGE-D1對EMSCs的增殖能力存在抑制作用，這與在腫瘤細(xì)胞中的研究結(jié)果不盡相同，但是其遷移能力存在顯著提高，因此，我們更深入探討了影響這種遷移能力可能存在的機(jī)制。

外胚間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和增殖對牙發(fā)育過程中上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)移和新陳代謝非常重要，涉及到很多基因調(diào)控著很多過程。E-Cadherin 作為細(xì)胞間的膠體，介導(dǎo)同種鈣依賴的細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附，它的胞漿部分與β-catenin相結(jié)合，其能夠使黏附復(fù)合體相連接到actin細(xì)胞骨架上[27]。兩者形成的細(xì)胞黏附系統(tǒng)被稱為“侵襲抑制系統(tǒng)”。國外研究者表明，WNT3a可以誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞β-catenin的細(xì)胞核內(nèi)移位，并高表達(dá)激活WNT信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的遷移[28]，重組小鼠釉原蛋白也存在相同功能[29]。MAGE-D1能夠促使β-catenin由細(xì)胞膜分布轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，破壞E-cadherin和β-catenin的結(jié)合，抑制了E-cadherin和β-catenin介導(dǎo)的鈣離子依賴的細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附。過表達(dá)NRAGE可誘導(dǎo)β-catenin發(fā)生O-乙酰氨基糖基化修飾，促進(jìn)β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)β-catenin與DNA的結(jié)合能力。但由于糖基化的存在，β-catenin與Pygopus的結(jié)合受到抑制，進(jìn)一步抑制了WNT信號通路[30]。本研究中，劃痕法顯示，MAGE-D1的下調(diào)促進(jìn)了外胚間充質(zhì)干細(xì)胞的遷徙。RealTime-PCR檢測與Western blot檢測結(jié)果相一致，下調(diào)MAGE-D1后上調(diào)了β-catenin表達(dá)，下調(diào)了E-Cadherin 表達(dá)。相似的是，Xue等[9]發(fā)現(xiàn)人MAGE-D1通過抑制E-Cadherin/β-catenin復(fù)合體能夠抑制U2OS細(xì)胞間的黏附。還有研究者發(fā)現(xiàn)在含氧量正常和缺氧的條件下，MAGE-D1都能夠抑制細(xì)胞的遷徙侵襲和黏附[10]。MAGE-D1同樣被報道能夠在體內(nèi)和體外抑制黑色素瘤和胰腺癌的新陳代謝[12]。

因此，我們發(fā)現(xiàn)在牙胚來源的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力的改變機(jī)制中，MAGE-D1可能參與其中并發(fā)生重要的作用，研究結(jié)果對牙發(fā)育上皮—間充質(zhì)相互轉(zhuǎn)換遷移提供了一定的理論支持，為牙發(fā)育組織工程的進(jìn)一步發(fā)展添磚加瓦。然而牙發(fā)育過程中涉及到的基因蛋白網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，實(shí)現(xiàn)牙發(fā)育組織工程化仍然需要大量的基礎(chǔ)、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)及臨床研究，而本團(tuán)隊將繼續(xù)深入相關(guān)研究，加快牙組織工程化進(jìn)程。