徐靜雅，李 均，付 旭

(1.遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 中藥應用與基礎研究重點實驗室，廣東 珠海 519000; 2.淄博市中心醫(yī)院 腎內(nèi)科，山東 淄博 255000)

腎臟纖維化是慢性腎臟疾病(chronickidneydisease,CKD)發(fā)展至終末期腎病(end-stage renal disease ，ESRD)的共同通路[1]，包括腎小管間質纖維化、腎內(nèi)血管硬化及腎小球硬化。課題組前期研究及相關文獻證實丹參水溶性成分丹酚酸B、C可下調(diào)單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠腎組織α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型膠原(Collagen I,ColⅠ)表達，抑制腎小管上皮細胞轉分化，減緩腎纖維化進程[2]。丹參脂溶性成分丹參酮ⅡA具有較強抗炎、抗氧化作用，能有效清除氧自由基和改善微循環(huán)[3]，并在抗腎纖維化過程中具有一定的防治作用[4]。Notch信號通路通過調(diào)控多種細胞增殖、分化在器官組織發(fā)育和發(fā)展平衡中發(fā)揮重要作用；γ-分泌酶抑制劑(γ-secretase inhibitor,DAPT)作為該通路內(nèi)調(diào)節(jié)因子可有效抑制γ-分泌酶復合體阻斷Notch通路傳導作用[5]。查閱文獻發(fā)現(xiàn)中西醫(yī)分子藥物之間配伍抗腎纖維化的研究少見報道，未發(fā)現(xiàn)DAPT配伍中藥有效成分在防治腎纖維化方面的相關研究。據(jù)此課題組采用目前成熟應用于研究腎間質纖維化的UUO動物模型[6]，觀察丹參脂溶性活性成分丹參酮ⅡA配伍西藥DAPT對UUO模型大鼠腎臟α-SMA、ColⅠ表達的影響，探索中西藥物結合對腎臟纖維化的干預作用，以期為丹參酮ⅡA配伍DAPT防治腎間質纖維化提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級清潔健康SD雄性大鼠40只，10～12周，體重(200±20) g。由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2013-0002。

1.2 藥物與試劑 丹參酮ⅡA (大連美侖生物科技公司，M1205A)，DAPT(Solarbio，330A031)，尿微量白蛋白(urine micro-albumin，UMA) 試劑盒和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-Acety-β-D-Glucosaminidase,NAG)試劑盒(上海科華生物工程股份有限公司，編號 20170112、20170522)，兔抗鼠α-SMA單克隆抗體(sigma，產(chǎn)品編號A5228)，兔抗鼠Ⅰ型膠原多克隆抗體(博奧森生物公司，bs-10423R)。

1.3 儀器 日立7020全自動生化分析儀(日本株式會社日立)，BX43奧林巴斯生物顯微鏡(OLYMPS,日本)，Multiskan GO全波長酶標儀(Thermo Fisher Scientific，美國)。

1.4 方法

1.4.1 動物模型建立及分組 給藥根據(jù)文獻建立單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化模型[7]。3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，右側腹部腎臟位置剃毛，消毒，切開皮膚，分離筋膜肌肉層，暴露右側腎臟及腎門，正常組縫合關腹，造模組于緊貼腎門處結扎輸尿管，再于輸尿管遠離腎門處二次結扎，在兩結扎點間剪斷輸尿管以防逆行性感染。依次縫合肌肉、皮下組織及皮膚。40只大鼠隨機分為正常組、模型組、丹參酮ⅡA組(丹參酮ⅡA 25 mg/kg)、DAPT組(DAPT 12 mg/kg)和丹參酮ⅡA+DAPT組(丹參酮ⅡA和DAPT分別為25、12 mg/kg)，每組8只。依據(jù)文獻查詢及預實驗不同劑量干預結果，干預組取最佳給藥劑量。藥物用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成相應濃度，給藥體積為10 mL/kg，于造模第2天起給藥，14 d后結束(ig，qd)，正常組及模型組給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液10 mL/kg。

1.4.2 觀察檢測指標

1.4.2.1 尿NAG和微量白蛋白含量測定 末次給藥后用代謝籠收集過夜尿液，采用全自動生化分析儀檢測尿液NAG、微量白蛋白。

1.4.2.2 腎組織病理，右側腎臟取出后由4%多聚甲醛溶液固定24 h，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋過程制成3 μm石蠟切片。①常規(guī)HE染色，每組大鼠制片8張，隨機選取10個互不重疊視野，光鏡下觀察大鼠腎小管和腎間質病變情況；按Banff分級進行半定量計分，即0分：正常；1分：小管間質病變范圍<25%；2分：病變范圍26%～50%；3分：病變范圍>50%。②Masson染色，每組8張切片在400倍鏡視野下觀察10個互不重疊間質視野，根據(jù)纖維染色陽性面積比例進行半定量分析，評分標準：0分：正常；1分：陽性面積<1/4；2分：陽性面積在1/4～1/2之間；3分：陽性面積>1/2。

1.4.2.3 大鼠腎組織α-SMA及ColⅠ表達檢測3 μm切片經(jīng)脫蠟水化，枸櫞酸微波爐高溫抗原修復后按免疫組織化學SP法步驟操作。應用Image-Pro-Plus6.0圖像分析軟件，在400倍鏡視野下計算單位面積平均光密度，每組實驗動物8只，每只采集3張切片，每組隨機選取12張。

2 結果

2.1 丹參酮ⅡA配伍DAPT對UUO大鼠腎組織病理改變的影響

2.1.1 HE染色評分 正常組大鼠腎小球腎小管結構正常，大小均勻，排列緊密，無炎性細胞浸潤；模型組腎小管代償性擴張、萎縮，排列稀疏，小管間質明顯增寬，間質內(nèi)大量炎性細胞彌漫性浸潤，纖維化明顯。丹參酮ⅡA組大鼠腎小管擴張成囊狀，部分萎縮。DAPT組大鼠腎小管部分基底膜斷裂，腎間質大量炎性細胞浸潤。丹參酮ⅡA+DAPT組大鼠僅見少量腎小管部分擴張，腎間質未見明顯炎性細胞浸潤。各干預組HE評分均較模型組降低(P<0.05)，丹參酮ⅡA+DAPT組評分明顯低于丹參酮ⅡA組和DAPT組(P<0.05，見圖1)。

A：正常組；B：模型組；C：丹參酮ⅡA25 mg/kg組； D：DAPT12 mg/kg組；E：丹參酮ⅡA+DAPT組 25 mg/kg+12 mg/kg；F：腎間質損傷評分。黑色箭頭所指為腎小管，紅色箭頭所指為炎癥細胞。*表示與正常組比較，P<0.05；#表示與模型組比較，P<0.05；▼表示與丹參酮ⅡA +DAPT組比較，染色，×400。圖1 丹參酮ⅡA配伍DAPT對UUO大鼠腎組織病理改變的影響

2.1.2 Masson評分 正常組大鼠腎臟膠原無或僅少量呈絲狀沉積。模型組腎臟膠原沉積于腎小管上皮，間質呈彌漫性分布，膠原染色呈藍色。丹參酮ⅡA組大鼠腎間質有部分膠原沉積。DAPT組腎間質有部分膠原沉積。丹參酮ⅡA+DAPT組大鼠腎組織膠原僅有少量呈絲狀沉積。模型組及各干預組較正常組均顯著升高(P<0.05)，說明UUO大鼠腎組織纖維化嚴重。各干預組較模型組均顯著下降(P<0.05)，表明丹參酮Ⅱ、DAPT單一用藥與配伍用藥均可一定程度上改善大鼠膠原沉積(P<0.05)。各干預組間比較，丹參酮ⅡA+DAPT組評分下降明顯，其中 DAPT組與丹參酮ⅡA+DAPT組比較有顯著性差異(P<0.05，見圖2)。

A：正常組；B：模型組；C：丹參酮ⅡA25 mg/kg組； D：DAPT12 mg/kg組；E：丹參酮ⅡA+DAPT組 25 mg/kg+12 mg/kg；F：間質纖維化評分。黑色箭頭所指為膠原纖維沉積。*表示與正常組比較，P<0.05；#表示與模型組比較，P<0.05；▼表示與丹參酮ⅡA +DAPT組比較，染色，×400。圖2 丹參酮ⅡA配伍DAPT對UUO大鼠腎間質纖維化的影響

2.2 尿NAG及微量白蛋白水平 模型組尿NAG、微量白蛋白水平與正常組比較明顯升高(P<0.05)；各干預組與模型組比較微量白蛋白丹參酮ⅡA組、丹參酮ⅡA +DAPT組水平均降低(P<0.05)。各干預組與模型組比較，尿NAG有升高趨勢，但無統(tǒng)計學意義(見表1)。

組別劑量(mg/kg)NAG(μmol/L)UMA(mg/L)正常-3.05±0.170.69±0.10模型-3.53±0.29*0.99±0.19*丹參酮ⅡA253.77±0.29*0.67±0.12#DAPT123.88±0.17*0.80±0.24丹參酮ⅡA +DAPT25+123.87±0.18*0.66±0.20#

*：表示與正常組比較，P<0.05；#：表示與模型組比較，P<0.05。

2.3 檢測腎組織α-SMA及ColⅠ

2.3.1 α-SMA表達的變化 模型組α-SMA平均光密度較正常組升高(P<0.05)；各干預組α-SMA平均光密度較模型組降低(P<0.05)；各干預組間比較，丹參酮ⅡA+DAPT組α-SMA平均光密度低于丹參酮ⅡA與DAPT組(P<0.05，見表2)。正常組腎間質及基膜僅見極少量棕黃色顆粒分布；模型組腎間質以及基底膜中，棕黃色顆粒彌漫分布；丹參酮ⅡA組部分腎間質和腎小管基膜有較密集的棕黃色顆粒沉積；DAPT組腎間質、腎小管基膜可見棕黃色沉積；丹參酮ⅡA+DAPT組棕黃色顆粒與腎間質少量分布(見圖3)。

組別劑量(mg/kg)α-SMA(平均光密度值×10-2)Col Ⅰ(平均光密度值×10-2)正常-1.519 1±0.359 62.716 0±0.352 3模型-9.880 9±0.559 4*13.037 3±0.983 8*丹參酮ⅡA257.311 3±0.770 0*#▼4.624 2±0.570 8*#DAPT126.020 4±1.518 8*#▼8.952 2±1.307 5*#▼丹參酮ⅡA+DAPT12+253.608 7±0.351 8*#3.697 3±0.234 9*#

*:表示與正常組比較，P<0.05；#：表示與模型組比較，P<0.05，▼：表示與丹參酮ⅡA +DAPT組比較，P<0.05。

A：正常組；B：模型組；C：丹參酮ⅡA25 mg/kg組； D：DAPT12 mg/kg組；E：丹參酮ⅡA+DAPT組 25 mg/kg+12 mg/kg；黑色箭頭所指為α-SMA表達的棕黃色顆粒沉積免疫組化染色，×400。圖3 丹參酮ⅡA配伍DAPT對UUO大鼠腎組織α-SMA表達的影響

2.3.2 Col Ⅰ表達的變化 模型組Col Ⅰ平均光密度較正常組升高(P<0.05)；各干預組Col Ⅰ平均光密度較模型組均降低(P<0.05)；其中丹參酮ⅡA+DAPT組Col Ⅰ平均光密度治療作用最為顯著(見表2)。正常組腎組織毛細管旁有少量棕黃色顆粒分布；模型組腎小球腎間質及基底膜可見致密棕黃色顆粒沉積；丹參酮ⅡA棕黃色顆粒散在分布；DAPT組腎組織可見大量棕黃色沉積；丹參酮ⅡA+DAPT組病變較其余治療組效果最為明顯，僅有少量棕黃色顆粒沉積(見圖4)。

A：正常組；B：模型組；C：丹參酮ⅡA25 mg/kg組； D：DAPT12 mg/kg組；E：丹參酮ⅡA+DAPT組 25 mg/kg+12 mg/kg；黑色箭頭所指為Col Ⅰ表達的棕黃色顆粒沉積免疫組化染色，×400。圖4 丹參酮ⅡA配伍DAPT對UUO大鼠腎組織Col Ⅰ表達的影響

3 討論

慢性腎病具有高發(fā)病率、高死亡率的特點，成為日漸重要的全球公共衛(wèi)生問題[8]。腎臟纖維化的病理改變主要為細胞外基質(extra cellular matrixc,ECM )的沉積，如纖維連接蛋白和膠原蛋白，以及腎臟固有細胞向肌成纖維細胞轉分化[9]。在間質組織穩(wěn)態(tài)中，膠原蛋白的產(chǎn)生與沉積取決于基質中膠原降解與重塑的平衡[10]。目前研究表明膠原酶抑制劑可阻礙膠原蛋白降解過程，導致I型膠原蛋白異常表達，引起細胞外基質過度沉積[11]，其中I型膠原蛋白在纖維沉積過程中占據(jù)主導地位，另有研究發(fā)現(xiàn)I型膠原可誘導間充質細胞向肌成纖維細胞轉分化，成為評估疾病預后有價值的指標[12-13]。肌成纖維細胞(myofibroblast,MF)是合成ECM的重要細胞,特異性表達α-SMA,與組織纖維化的發(fā)展密切相關。在正常大鼠腎臟組織中，α-SMA僅在動脈平滑肌細胞中表達。Picard等[14]研究發(fā)現(xiàn)，UUO術后第 1 天，腎間質中便可見α-SMA異常表達，腎間質中固有成纖維細胞轉分化在UUO術后早期即可啟動，隨著病變時間持續(xù)，腎間質中α-SMA 的表達呈進行性增加。因此，I型膠原蛋白與α-SMA參與了纖維化過程，在腎纖維化機制研究中具有重要作用。

丹參為唇形科植物，具有活血祛瘀、涼血消癰的功效。研究提示：確定中藥方劑中的有效成分及其配伍規(guī)律，是目前中醫(yī)藥基礎研究的趨勢與熱點[15]。課題組前期重點研究了丹參黃芪藥對配伍以及丹參水溶性成分丹酚酸A、B、C分子藥對配伍防治腎纖維化的效應，闡釋了丹參水溶性有效成分配伍在防治慢性腎臟病的部分機制[16-17]。新近基礎研究顯示，丹參脂溶性成分丹參酮ⅡA可顯著降低大鼠腎組織間充質標志性細胞α-SMA的表達[4]，維持人腎小管上皮細胞(HK-2)形態(tài)穩(wěn)定，抑制轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的誘導，減少I型膠原蛋白的分泌[19]，丹參酮ⅡA在腎纖維化病理進程中的防治作用同樣不可忽視。Notch信號通路在肌成纖維轉分化過程中具有誘導作用，其特異性抑制劑DAPT可靶向阻斷Notch信號通路，下調(diào)TGF-β的表達和釋放，抑制上皮細胞轉分化和膠原的累積[19]。Bielesz等[5]在葉酸誘導小鼠腎纖維化模型及UUO模型中，證實DAPT可緩解腎間質纖維化的進展，抑制I型膠原蛋白合成；由此可見DAPT可能成為延緩腎纖維化的治療手段。雖然丹參酮ⅡA與DAPT在腎纖維化進展中均具有一定防治作用，但二者中西藥物結合聯(lián)用后是否產(chǎn)生更好的防治屬性鮮見研究報道。因此課題組通過建立UUO大鼠模型，研究丹參酮ⅡA配伍DAPT對腎纖維化的影響，為中西分子藥對配伍抗腎纖維化提供新的模式，深入研究抗腎纖維化的分子機制。實驗結果顯示，丹參酮ⅡA、DAPT 及其配伍可阻礙腎間質膠原纖維沉積及腎組織損傷，有效下調(diào)α-SMA的表達，其中丹參酮ⅡA+DAPT 組效果最佳；各干預組均可有效下調(diào)ColⅠ的表達，其中丹參酮ⅡA+DAPT組與丹參酮ⅡA組比較ColⅠ有下降趨勢但無統(tǒng)計學意義，表明丹參酮ⅡA配伍DAPT的協(xié)同作用對ColⅠ表達的下調(diào)作用不明顯，但二者配伍是否通過其他類型膠原在纖維化進展中發(fā)揮協(xié)同作用需進一步深入研究。

Notch信號分子在腎臟發(fā)育階段起主導作用[20-21]，并在成人急性腎損傷后修復階段對腎小球存活、增殖和分化起重要作用，其中非選擇性Notch活化劑DLL4可促進腎功能的恢復，其作用機制可能與Notch不同受體作用相關[22]，雖尚未有詳細研究，但有實驗數(shù)據(jù)表明Notch2對急性腎損傷后腎小球細胞的再生和增殖十分關鍵[23]。腎小球濾過功能受損是蛋白尿形成的主要原因，本實驗結果顯示，丹參酮ⅡA組及配伍組可有效減輕尿微量白蛋白形成，DAPT組與模型組比較雖有下降趨勢但無統(tǒng)計學意義，其結果可能由DAPT組早期即對notch信號阻斷導致，一定程度上抑制了早期腎小球細胞的再生修復，加重損害腎小球濾過功能。尿NAG是廣泛應用于臨床早期檢測腎小管損傷的標記物，Sinha等[24]研究發(fā)現(xiàn)在腎損傷動物模型中，NAG于第六天升高達最高峰，隨著腎小管形態(tài)學改變呈重度時，NAG升高趨勢較前相比有所下降。腎纖維化是慢性腎臟病發(fā)展至終末期的表現(xiàn)，本實驗形態(tài)學結果顯示，模型組腎小管損傷嚴重、纖維化彌漫分布，各干預組較模型組的腎組織形態(tài)均有明顯改善，本研究造模周期為14 d，實驗結果顯示，各干預組與模型組比較，尿NAG有升高趨勢但無統(tǒng)計學意義，表明模型組終末期腎小管重度損傷NAG回降，干預組經(jīng)藥物干預腎組織損傷程度仍處于早中期升高階段。

綜上，丹參酮ⅡA配伍DAPT對UUO大鼠腎臟纖維化具有一定防護作用，可能成為今后延緩腎間質纖維化進展新的藥對配伍之一。但兩者協(xié)同作用機制以及是否通過協(xié)同干預Notch信號通路發(fā)揮抗腎纖維化作用值得深入研究。