安文亞，吳宇波，羅江艷，趙澤駒，羅逸航，辜 浩

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 泌尿外科，貴州 遵義 563099)

輸尿管不全梗阻臨床較為多見，梗阻時(shí)間越長平滑肌不可逆性損害越重，梗阻近端輸尿管擴(kuò)張、積水、腎盂高壓波及腎實(shí)質(zhì)，腎功能進(jìn)行性減退[1]；在梗阻過程中輸尿管病理生理變化先于腎臟，適時(shí)干預(yù)有利于挽救輸尿管及腎功能，又使非手術(shù)治療得以實(shí)現(xiàn)。輸尿管梗阻臨床上較為常見，梗阻發(fā)生后其基本病理生理改變?yōu)楣Ｗ杞溯斈蚬軌毫ι?，輸尿管擴(kuò)張、積水，持續(xù)梗阻最終導(dǎo)致腎功能不可逆性損害，因?qū)δI臟的損害可以較為快速的發(fā)現(xiàn)，以至于梗阻性疾病的研究重點(diǎn)關(guān)注了腎損害，其實(shí)，輸尿管梗阻后近端輸尿管病理性改變先于腎臟，部分輸尿管梗阻解除后腎功能基本恢復(fù)。本文用SD大鼠輸尿管不全梗阻模型，研究了梗阻不同時(shí)段輸尿管形態(tài)結(jié)構(gòu)及平滑肌肌球蛋白表達(dá)，以期為臨床掌控輸尿管不全梗阻解除時(shí)間提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康10～12周齡普通級SD大鼠120只，雌性各半，體重250～300 g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK-(渝)2012-0005。飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，雌雄分開，普通標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，每2～3天更換墊料，室溫18～22 ℃，相對濕度45%～65%，3周后隨機(jī)分為正常組30只，模型組和實(shí)驗(yàn)組各45只。

1.1.2 主要試劑和儀器 肌球蛋白兔抗大鼠一抗(SA1022)、抗體稀釋液(AR10161)、即用型正常山羊血清(AR0009，武漢博士德生物工程有限公司)；肌球蛋白二抗免疫組化試劑盒(GK500705，上海基因科技有限公司)；CKX31普通光學(xué)倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；IPWin32采圖系統(tǒng)(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及標(biāo)準(zhǔn)化 正常組不實(shí)施干擾，模型組SD大鼠稱重后，10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉有效后固定、剪毛、消毒，取下腹正中切口，切開進(jìn)入腹腔，探查無異常后找到膀胱，分離右側(cè)輸尿管下段約2.0 cm，于后方腰大肌鈍性分離出一條長約2.0 cm、深約0.5 cm的裂隙，不做輸尿管腰大肌隧道包埋，腹腔放少量青霉素，縫合腹部切口；實(shí)驗(yàn)組在模型組基礎(chǔ)上參照腰大肌隧道包埋法將游離的下段放置于裂隙底部[2-3]， 1-0絲線間斷縫合2針關(guān)閉裂隙，腹腔放少量青霉素后縫合切口，繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.2.2 標(biāo)本采集 術(shù)后1、2、3周隨機(jī)選擇正常組10只、模型組及實(shí)驗(yàn)組各15只處死，分離、切取右側(cè)腎及輸尿管；實(shí)驗(yàn)組找到右側(cè)輸尿管下段包埋處線結(jié)，分離顯露輸尿管、腎臟，近膀胱壁剪斷輸尿管，擠壓腎臟見尿液從近側(cè)斷端流出，切除右側(cè)腎臟、輸尿管；觀察各組輸尿管及腎臟形態(tài)，拍照，部分輸尿管用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片備組織病理與免疫組化用。

1.2.3 輸尿管直徑測量 完整分離輸尿管及腎臟，標(biāo)記輸尿管梗阻部位，用游標(biāo)卡尺(0.05 mm)測量輸尿管中、上段直徑(均分三段測量)記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 組織病理及免疫組化 將輸尿管中、上段石蠟切片常規(guī)梯度脫蠟至水，一部分用于HE染色觀察其不同時(shí)間的組織結(jié)構(gòu)變化；另一部分用于平滑肌肌球蛋白檢測，按試劑盒說明，SP法逐步實(shí)施，陰性對照用PBS代替一抗；結(jié)果判斷：鏡下平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)見黃色或棕黃色顆粒為陽性；細(xì)胞胞漿內(nèi)未見黃色或棕黃色顆粒為陰性；用Leica Qwin圖像處理系統(tǒng)采集圖像，每張切片采集4～5張圖片，并用Image-proplus 6.0圖像分析軟件測量平均積分光密度(IOD)進(jìn)行相對定量分析。

2 結(jié)果

2.1 模型效果與樣本 本實(shí)驗(yàn)由同一組實(shí)驗(yàn)人員在中心實(shí)驗(yàn)室完成，建模順利； SD大鼠120只中117只達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，死亡3只中包括模型組3周時(shí)1只，實(shí)驗(yàn)組1、3周各1只，正常組無死亡；納入統(tǒng)計(jì)的正常組30只，模型組44只，實(shí)驗(yàn)組43只，切取的右側(cè)腎、輸尿管數(shù)量與之相同。

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠大體觀察 正常組與模型組腎、輸尿管大體形態(tài)比較無明顯差異；實(shí)驗(yàn)組右側(cè)梗阻近端輸尿管直徑增粗、腎臟體積增大與其比較差異顯著，且梗阻不同段間也存在差異：1周，右側(cè)梗阻近端輸尿管稍增粗，腎臟體積約有增大、張力稍高；2周，梗阻以上輸尿管增粗明顯，壁厚，腎臟體積增大、包膜張力高、皮質(zhì)變薄、腎盂擴(kuò)張；3周，梗阻近端輸尿管增粗顯著，管壁明顯變薄，腎臟體積增大、外形不規(guī)則，腎盂、腎盞分離，腎實(shí)質(zhì)菲薄，腎盂、腎盞變形擴(kuò)大(見圖1)。

A1、2、3：正常組1、2、3周；B1、2、3：模型組1、2、3周；C1、2、3：實(shí)驗(yàn)組1、2、3周。圖1 各組大鼠不同時(shí)段輸尿管及腎臟形態(tài)學(xué)變化

2.3 輸尿管不同時(shí)段直徑變化 正常組與模型組比較，輸尿管直徑變化統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組與模型組、正常組比較，實(shí)驗(yàn)組不同周間比較，輸尿管直徑變化均有顯著差異(P<0.01，見表1)。

組別例數(shù)1周2周3周正常301.061±0.020#1.041±0.012▲1.045±0.021▼模型441.049±0.076#1.041±0.030▲1.046±0.033▼實(shí)驗(yàn)431.422±0.141#△2.413±0.387▲△4.232±0.396▼△

1周：正常組、模型組及實(shí)驗(yàn)組比較，#：P<0.01；2周：正常組、模型組及實(shí)驗(yàn)組比較，▲：P<0.01；3周：正常組、模型組及實(shí)驗(yàn)組比較，▼：P<0.01；1、2、3周實(shí)驗(yàn)組比較，△：P<0.01。

2.4 HE染色觀察輸尿管組織病理變化 正常組及模型組右側(cè)輸尿管平滑肌細(xì)胞排列規(guī)律、完整，細(xì)胞核呈長橢圓形，無明顯核異型，與實(shí)驗(yàn)組間差異較大；實(shí)驗(yàn)組1周，右側(cè)輸尿管壁稍增厚，平滑肌層為主，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，可見部分細(xì)胞代償性肥大，間質(zhì)增生的纖維結(jié)締組織延伸到細(xì)胞間，細(xì)胞間連續(xù)性及規(guī)律性被局部被破壞；2周，右側(cè)輸尿管壁明顯增厚，肌層明顯增生肥厚，細(xì)胞排列紊亂，體積增大，胞核成長梭型，漿膜下部分纖維也有增生；3周，右輸尿管壁明顯變薄，肌層明顯，細(xì)胞萎縮，體積變小，細(xì)胞核變小變圓，大量纖維增生取代平滑肌(見圖2)。

2.5 輸尿管平滑肌肌球蛋白表達(dá) 正常組、模型組及實(shí)驗(yàn)組各周平滑肌肌球蛋白均有不同程度的表達(dá)，彼此間表達(dá)量存在差異(見圖3)；正常組與模型組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，二者與實(shí)驗(yàn)組各周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組1、2周平滑肌肌球蛋白表達(dá)量明顯高于正常組和模型組，第3周組表達(dá)量卻顯著低于模型和正常組(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)組各周間表達(dá)量也存在顯著差異，2周組>1周組>3周組(P<0.01)(見表2)；整個實(shí)驗(yàn)中平滑肌肌球蛋白表達(dá)強(qiáng)弱順序?yàn)椋簩?shí)驗(yàn)組2周>實(shí)驗(yàn)組1周>正常組與模型組>實(shí)驗(yàn)組3周。

A1、2、3：正常組1、2、3周；B1、2、3：模型組1、2、3周；C1、2、3：實(shí)驗(yàn)組1、2、3周；(HE，×200)。 圖2 各組大鼠不同時(shí)段輸尿管病理學(xué)改變

A1、2、3：正常組1、2、3周；B1、2、3：模型組1、2、3周；C1、2、3：實(shí)驗(yàn)組1、2、3周；D：空白對照組；(IHC，×400)。 圖3 各組大鼠不同時(shí)段輸尿管平滑肌肌球蛋白表達(dá)

組別例數(shù)1周2周3周正常300.109±0.004#0.110±0.007▲0.103±0.006▼模型440.111±0.008#0.113±0.004▲0.112±0.007▼實(shí)驗(yàn)430.146±0.009#△0.221±0.052▲△0.059±0.017▼△

1周：正常組、模型組及實(shí)驗(yàn)組比較，#：P<0.01；2周：正常組、模型組及實(shí)驗(yàn)組比較，▲：P<0.01；3周：正常組、模型組及實(shí)驗(yàn)組比較，▼：P<0.01；1、2、3周實(shí)驗(yàn)組比較，△：P<0.01。

3 討論

輸尿管不全梗阻臨床較為常見，多與結(jié)石有關(guān)，部分梗阻過早解除挽救了腎及輸尿管功能，卻使非手術(shù)治療失去意義，如較小的輸尿管中、下段結(jié)石不全性梗阻急性期手術(shù)干預(yù)[4]；另一部分則因梗阻解除過晚致近端輸尿管過度擴(kuò)張、積水、腎臟代償性積水增大、實(shí)質(zhì)萎縮，梗阻消除后輸尿管仍擴(kuò)張、積水、收縮乏力，為較小結(jié)石、尿鹽結(jié)晶、脫落壞死組織或感染性膿苔等形成梗阻提供了機(jī)會，時(shí)常誘發(fā)急性梗阻、腎衰[5]，且非手術(shù)治療效果差?？梢娸斈蚬懿蝗Ｗ柽m時(shí)解除非常重要，不僅可以充分實(shí)施非手術(shù)治療，使部分患者受益，還有利于及時(shí)手術(shù)干預(yù)，恢復(fù)輸尿管及和腎臟功能，那么到底什么時(shí)間解除梗阻較為適宜，目前尚缺相關(guān)共識[6]，據(jù)此，我們用SD大鼠輸尿管不全梗阻模型進(jìn)行了研究，獲得了較為可靠的結(jié)果。

輸尿管是肌性、管狀、空腔器官，依賴平滑肌節(jié)律性收縮協(xié)助排尿，梗阻一旦發(fā)生，尿液滯留，梗阻近端壓力升高，反射性輸尿管、腎盂平滑肌收縮力增加，以期排出更多尿液緩解壓力，保護(hù)腎臟泌尿功能；如果梗阻時(shí)間延長，尿液不能排出，完全性梗阻，近端積水及壓力將進(jìn)一步升高，腎盂壓>10 mmHg時(shí)出現(xiàn)腎實(shí)質(zhì)返流，腎血流分布改變，髓質(zhì)流量增加，泌尿功能逐漸下降到停止[7]；此時(shí)，輸尿管、腎盂維持高壓，功能停止，不可逆性損害持續(xù)，一經(jīng)診斷需立即解除梗阻方可挽救其功能，與臨床上所見完全性輸尿管梗阻、腎盂輕度擴(kuò)張積水、腎臟體積增大不明顯或縮小，鏡下呈纖維化萎縮。不全性梗阻，因始終有部分尿液排出，梗阻近端壓力有一定程度的緩解，輸尿管、腎盂平滑肌收縮、擴(kuò)張以期排出更多尿液，呈現(xiàn)由代償?shù)绞Т鷥數(shù)霓D(zhuǎn)化過程，輸尿管擴(kuò)張、積水逐漸增加，波及腎臟后腎積水、體積增大、實(shí)質(zhì)萎縮也逐漸發(fā)展，最終使輸尿管過度擴(kuò)張?jiān)龃诸愃朴凇澳c管”，巨大腎積水形成，輸尿管壁及腎實(shí)質(zhì)均菲薄，腎單位耗竭，尿量卻基本維持穩(wěn)定，即使梗阻解除，輸尿管及腎功能已不可能有效恢復(fù)[8]；該過程中輸尿管病理損害先于腎臟，部分輸尿管梗阻解除后腎功能基本恢復(fù)[9]。

輸尿管平滑肌最先受累，肌球蛋白是平滑肌纖維主要結(jié)構(gòu)與功能單蛋白，在梗阻性病變中，肌細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)破壞，出現(xiàn)鈣超載，線粒體、肌球蛋白等超微結(jié)構(gòu)異常[10-11]，肌球蛋白的變化較早，研究其變化規(guī)律可反映不同時(shí)段輸尿管平滑肌功能狀態(tài)，對保護(hù)輸尿管及腎臟有預(yù)警作用，及時(shí)阻止可以挽救腎功能；實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)輸尿管不全梗阻隨時(shí)間延長，近端輸尿管逐漸擴(kuò)張，2、3周間變化較明顯，與其它各組間形成顯著差異，腎盂擴(kuò)張積水與腎臟體積增大也呈相應(yīng)變化，提示輸尿管梗阻性改變波及腎臟損害；鏡檢與大體觀察結(jié)果類似：梗阻2周輸尿管平滑肌層增厚，細(xì)胞代償性增生肥大，核變大，長梭型；第3周管壁平滑肌纖維明顯減少，肌層變薄、細(xì)胞萎縮、核小而圓、細(xì)胞排列紊亂、纖維增生明顯，與2周前形成顯著差異，肌球蛋白的表達(dá)量在1、2周也呈現(xiàn)增加，3周時(shí)顯著降低，甚至低于陰性對照與對照組，說明不全梗阻過程中，平滑肌細(xì)胞經(jīng)歷了由代償期肌球蛋白合成增加、肌纖維增粗向失代償性降低與減少的過程，肌球蛋白的這種顯著性變化是平滑肌不可逆性損害的標(biāo)志[12]，說明輸尿管不可逆性改變存在，只有解除梗阻才能阻止輸尿管及腎臟功能進(jìn)一步損害。

綜上所述，輸尿管不全梗阻平滑肌損傷性改變較早，其肌球蛋白表達(dá)的變化與平滑肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變相適應(yīng)；不全梗阻2周到3周間變化最為顯著，可能存在代償向失代償?shù)霓D(zhuǎn)化，超過2周，平滑肌不可逆性損害的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，建議臨床將輸尿管不全梗阻觀察期控制在2周，最好不超過3周，否則，即使解除梗阻，輸尿管功能也存在降低，并可能成為再發(fā)梗阻和長期影響腎功能的危險(xiǎn)因素。