游 興，魏在榮，陳 偉，鄧呈亮，張文奪，王達(dá)利，龔飛宇

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 燒傷整形外科，貴州 遵義 563099)

隨著機械化進(jìn)程的推進(jìn)，皮膚軟組織缺損病例在臨床上有增無減?？v使醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，已使得創(chuàng)面的簡單修復(fù)基本得到解決。但傷后感覺功能的重建往往比較棘手，尤其是常與外界接觸的四肢創(chuàng)面，感覺的重獲顯得尤為重要，目前臨床上已較成熟地應(yīng)用了帶感覺神經(jīng)的皮瓣進(jìn)行修復(fù)[1]，且效果滿意。但對于部分患者，因自身解剖變異或局部毀損過重，缺少甚至沒有可切取帶神經(jīng)皮瓣的理想供區(qū)，這部分患者感覺功能的重建給臨床醫(yī)師提出了新的要求，局部神經(jīng)再生成為了新的研究方向。以往在感覺功能重建方式上主要是針對痛、溫覺的恢復(fù)，然而感覺的完美重建應(yīng)該是多方面的，包括觸、壓、痛、溫等感覺。四肢是觸覺敏感部位，觸覺的減退或消失明顯影響患者生活質(zhì)量。Merkel細(xì)胞是一種皮膚上皮細(xì)胞[2]，數(shù)量很少，位于表皮、真皮交界處，和Aβ感覺神經(jīng)元形成一種特殊的類似突觸樣的聯(lián)系[3-4]。Merkel細(xì)胞存在于多數(shù)脊椎動物皮膚中的神經(jīng)末梢，已有研究[5]證實，該細(xì)胞在皮膚感受輕柔觸覺刺激活動中與神經(jīng)末梢形成特殊結(jié)構(gòu)而共同作用。本實驗基于體外Merkel細(xì)胞的成功培養(yǎng)，結(jié)合MEBO外用為創(chuàng)面愈合提供的有利微環(huán)境，聯(lián)合使用觀察其對足底縮足反射及創(chuàng)面新生皮膚神經(jīng)再生的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SD鼠100只(建模90只，繁殖幼鼠10只)，[SPF級，許可證號：SCXK(渝)2012-0005，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供]。MEBO(美寶濕潤燒傷膏，汕頭市美寶制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20000004)。

1.2 主要實驗儀器 超凈臺(TDGC2J0.5，中國，上海先鋒)；離心機(Centrifuge 5417R，德國，Eppendorf)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(3141I/R，Thermo 美國，Scientific)；顯微鏡及拍照系統(tǒng)(IX-71-S8F，日本，Olympus)；超純水系統(tǒng)(Milli-Q Biocel， Millipore，法國)；石蠟切片機(CM3050S，Leica，德國)；細(xì)胞培養(yǎng)板(6孔/12孔，Eppendorf，德國)；細(xì)胞過濾器(中國，上海生工)；以及相機、手術(shù)器械、移液器、離心管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、顯微器械、無菌手套、注射器、培養(yǎng)皿等等。

1.3 主要實驗試劑 兔抗鼠一抗CK20、山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗、小鼠抗NF-01抗體、兔抗鼠熒光二抗(abcam，美國)；重組β鼠神經(jīng)生長因子(PROSPEC)；抗體稀釋液、胰蛋白酶、中性蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液(碧云天，中國)；DAB、bFGF、中性樹膠、蘇木素、二甲苯(北京中杉金橋)；胎牛血清、山羊血清(Gibco，美國)；多聚甲醛、TritonX-100(上海生工)。

1.4 方法

1.4.1 Merkel原代細(xì)胞提取及培養(yǎng) 取新生的SD大鼠斷頭處死，75%酒精浸泡消毒5～10 min，超凈工作臺內(nèi)解剖大鼠須墊及足底皮膚，PBS 漂洗去除附帶組織及壞死細(xì)胞等雜質(zhì)，將組織剪碎為1.0 cm×0.2 cm大小的細(xì)小組織塊。移入50 mL的離心管中，按組織體積量(1∶4～5)中性蛋白酶(25 U/mL)室溫消化1 h分離真皮和表皮。然后將表皮剪碎成大小約 1.0 mm×1.0 mm 的微小組織塊，用0.25%胰蛋白酶溶液37 ℃消化30 min。完全培養(yǎng)基終止消化，收集消化液，以70 μm 孔徑的細(xì)胞過濾器逐次過濾，1 500 rpm 上機離心11 min，去上清液，最后加入 Ham，s-F12 培養(yǎng)基(含10%FBS、20 ng/mL bFGF)適量，制成細(xì)胞懸液并接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，放置于細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每日觀察，每2天換液1次。

1.4.2 免疫細(xì)胞化學(xué)PAP法鑒定 取原代細(xì)胞制作爬片，培養(yǎng)第6天取出爬片，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100和3%雙氧水依次通透處理，山羊血清封閉1 h，一抗CK20(1∶70)4 ℃孵育過夜。次日取出漂洗，HRP標(biāo)記的二抗(1∶70)37 ℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察拍照記錄。

1.4.3 動物模型建立及分組 建模前將大鼠置于底部帶孔的透明箱內(nèi)，檢測前允許適應(yīng)環(huán)境1 h。檢測各鼠左后足縮足反射并記錄縮足次數(shù)及反射情況。后麻醉固定，于左后足的底部標(biāo)記直徑為1 cm的圓形建模區(qū)域，術(shù)中垂直切開全層皮膚，直至皮下，妥善保護(hù)足底腱膜，切除皮膚，遺留圓形創(chuàng)面并徹底止血。手術(shù)部分均在無菌條件下操作。建模后將所有創(chuàng)面模型進(jìn)行完全隨機分組，采用基于Excel的隨機序列發(fā)生器軟件，分為5組并予相應(yīng)干預(yù)：MCs+MEBO組、MCs組、MEBO組、PBS組(陰性對照)以及mNGF組(陽性對照)。設(shè)定每組每個時間點為6只大鼠，總共3個取材時間點(第7、14、 21天)。細(xì)胞則取原代培養(yǎng)第8天MCs，計數(shù)后終濃度為106個/mL，細(xì)胞注射點分別為創(chuàng)緣3、6、9、12點及基底中央共5個點，注射器選用普通微量注射器，針頭選擇尖頭的，量程選為50 μL，每個點一次性注射同濃度的細(xì)胞懸液量體積各25 μL；陰性及陽性對照組分別以PBS、mNGF(濃度為0.1 μg/mL)等體積注射，24 h后追加注射一次，各組創(chuàng)面經(jīng)試驗干預(yù)后均用無菌紗布包扎，每日換藥一次，其中用MEBO外敷的實驗組用藥量以完全覆蓋創(chuàng)面為準(zhǔn)，厚度約2 mm。

1.4.4 創(chuàng)面大體觀察及足底行為學(xué)檢測 每日換藥觀察創(chuàng)面愈合情況并拍照記錄。觀察實驗干預(yù)后各模型足在行為狀態(tài)方面的變化，包括舔舐、步態(tài)、縮足等等。于建模后的三個時間節(jié)點(7 d、14 d、21 d)以棉拭子檢測模型足足底的縮足反應(yīng)情況。每只大鼠每個時間點共進(jìn)行5次，間隔10 s以上，統(tǒng)計建模干預(yù)后第7、14、21天三個時間點的各大鼠縮足次數(shù)，記錄并計算其百分比(縮足百分比=縮足次數(shù)/總刺激次數(shù)×100/100)?？v向比較第7、14、21天縮足次數(shù)有無增加，橫向比較各處理組在同一時相縮足次數(shù)有無差別。

1.4.5 免疫熒光染色檢測皮膚神經(jīng)再生 在動物模型建立后的第7、14、21天三個時間點，每個組提取6只實驗大鼠，先行行為學(xué)檢測，后麻醉固定取材，取材時深度以切取新生皮膚組織、保留足底腱膜為準(zhǔn)，取得標(biāo)本用多聚甲醛固定，石蠟包埋，后垂直于皮膚表面連續(xù)切片，切片厚約5 μm，以載玻片撈片。常規(guī)脫蠟至水，漂洗后胎牛血清封閉1 h，滴加小鼠抗NF-01抗體(濃度1∶500)，4 ℃過夜。次日取出漂洗，滴加FITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗工作液(1∶1 000)，避光孵育1 h，漂洗，抗熒光淬滅劑封片，拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠MCs的原代培養(yǎng) 從細(xì)胞提取及培養(yǎng)來看，用中性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶消化法能有效提取MCs。細(xì)胞增長較快，24 h即可見大量的細(xì)胞貼壁生長，貼壁生長細(xì)胞多呈不規(guī)則形或者多角形，其包膜可見“突觸”狀生長，并在換液過程中逐漸得到純化(見圖1)。

A:×100；B:×200；C:×400。 圖1 Merkel細(xì)胞的原代培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

2.2 MCs的免疫細(xì)胞化學(xué)染色 鑒定免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以抗體CK20標(biāo)記培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞被染成棕黃色視為陽性反應(yīng)。實驗結(jié)果見實驗組棕染色細(xì)胞數(shù)量較多，且形態(tài)多樣，有多角形及不規(guī)則形等。對照組則未見明顯棕黃色結(jié)果出現(xiàn)(見圖2)，說明培養(yǎng)細(xì)胞為目標(biāo)Merkel細(xì)胞。

2.3 創(chuàng)面大體觀察 實驗中各組大鼠足底創(chuàng)面均無感染發(fā)生。建模最初24 h內(nèi)創(chuàng)面周圍水腫較為明顯。在建模后第3天，各組模型鼠足底創(chuàng)面開始向心性回縮，其中應(yīng)用MEBO外敷處理組基底濕潤，持續(xù)觀察，基底創(chuàng)面肉芽生長較好。到建模處理后第7天時各組創(chuàng)面縮小程度更加明顯，MCs+MEBO組及MEBO組較其他處理組縮小幅度更多，水腫均已消退，創(chuàng)面開始結(jié)痂，新生皮膚自創(chuàng)緣往創(chuàng)面中心爬行呈現(xiàn)收縮性生長。等到建模第14天時， MEBO處理組創(chuàng)面接近完全愈合，而其他處理組也不同程度愈合。到建 模后第21天時各模型創(chuàng)面均完全愈合(見圖3)。

實驗組(A：×100；B：×400)；對照組(C：×100；D：×400)。 圖2 Merkel細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色

圖3 各組創(chuàng)面不同時間點大體愈合情況觀察

2.4 建模后創(chuàng)面愈合時間的比較 在各模型創(chuàng)面的愈合時間的比較上，MCs+MEBO組、MCs 組、MEBO 組以及mNGF組(陽性對照)明顯早于PBS組，MCs+MEBO組和MEBO組早于其他3組，其中又以MCs+MEBO組愈合最快。(P<0.05，見表1)。

2.5 大鼠行為學(xué)改變 大鼠足底創(chuàng)面模型建立后各組大鼠在精神狀態(tài)、進(jìn)食量和日常活躍程度上均無明顯的差異，但建模側(cè)均出現(xiàn)左后足(模型足)跛行甚至懸空，部分還出現(xiàn)縮足舔舐等行為；在縮足反應(yīng)百分比的比較上，MCs+MEBO組優(yōu)于MCs組、MEBO組、PBS組)，與mNGF組相近(見表2)。

組別創(chuàng)面數(shù)創(chuàng)面愈合時間(d)MCs+MEBO1814.33±0.69▲MCs1816.44±0.86▲△MEBO1814.83±0.71▲△PBS1817.44±0.98△mNGF1816.27±0.67▲

與PBS組比較▲:P<0.05；與MCs+MEBO組比較△:P<0.05。

組別縮足反應(yīng)(%)7 d14 d21 dMCs+MEBO23.33±8.1633.33±10.32**66.66±10.32▲MCs16.66±8.16*26.66±10.32**53.33±10.32▲MEBO16.66±8.16*26.66±10.32**43.33±8.16PBS16.66±8.16*23.33±8.16**36.66±8.16mNGF26.66±10.3246.66±10.3270.00±10.95

與同時間點mNGF組比較*:P<0.05，**:P<0.05。與同時間點PBS組比較，△:P<0.05。

2.6 免疫熒光檢測足底新生皮膚神經(jīng)再生 各組實驗標(biāo)本行石蠟切片后用免疫熒光染色顯示：MCs+MEBO組在第7天時有少量紊亂的、散在的神經(jīng)纖維絲；到第14天時從形態(tài)學(xué)上看神經(jīng)纖維絲的數(shù)量開始增多、直徑逐漸增大，但是神經(jīng)纖維絲排列仍然雜亂，多數(shù)是呈粗短狀；等到實驗第21天時，觀察MCs+MEB組的神經(jīng)纖維絲在數(shù)量上多于該組第14天時的神經(jīng)纖維絲數(shù)量，排列也開始逐漸變得有序。MCs+MEBO組在各觀察時相點的神經(jīng)纖維絲數(shù)量及直徑均與mNGF組相近。單用MCs組在創(chuàng)面愈合的早期并未明顯神經(jīng)纖維絲再生，但到建模后的第21天切片觀察，可見少量神經(jīng)纖維絲陽性染色出現(xiàn)；然而單用MEBO組、PBS組在實驗的觀察時間內(nèi)無明顯神經(jīng)纖維絲陽性染色的出現(xiàn)，僅偶見雜亂纖細(xì)的疑似神經(jīng)絲纖維狀染色出現(xiàn)(見圖4)。

×200，箭頭指示神經(jīng)纖維。 圖4 各實驗組3個時間點神經(jīng)纖維再生情況

3 討論

臨床上皮膚軟組織缺損的病例較為常見，尤其在四肢功能部位，皮膚軟組織缺損對患者影響較大，主要有局部功能的缺失，外觀的缺陷，經(jīng)久不愈的創(chuàng)面甚至可能發(fā)生癌變等。隨著臨床上各類皮瓣的成功應(yīng)用，創(chuàng)面的簡單修復(fù)已不再是難題，真正難為整形外科醫(yī)師的，是創(chuàng)面愈合后局部神經(jīng)功能的重獲。四肢是最常與外界接觸的部位，同時肢端更是觸覺的敏感部位，這些特殊部位在創(chuàng)面愈合后神經(jīng)功能的重塑對患者就顯得尤為重要。既往臨床上對四肢創(chuàng)面感覺功能的重建主要是恢復(fù)其痛覺及溫度覺，如隨皮瓣一起的自體神經(jīng)遠(yuǎn)位游離移植[6]、鄰近神經(jīng)轉(zhuǎn)位移植[7]等；實驗研究中有雪旺氏細(xì)胞[8]、脂肪干細(xì)胞[9-10]移植以及神經(jīng)生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子應(yīng)用[11-13]等促進(jìn)神經(jīng)再生。但在觸覺功能重建或再生方面鮮有體內(nèi)實驗報道。

Merkel細(xì)胞是位于表皮基底的一種樹突狀細(xì)胞，它與皮膚中的神經(jīng)末梢形成類似于解剖學(xué)上的“突觸聯(lián)系”[14-15]，該細(xì)胞與神經(jīng)末梢一起，作為一個“功能體”，主要參與輕柔觸覺刺激信號的傳導(dǎo)，在人類的指腹、嘴唇以及其他脊椎動物的毛囊等部位較為多見[16-17]。已有學(xué)者[18]設(shè)計實驗證實Merkel細(xì)胞內(nèi)Piezo2離子通道和Ca2+動作電位是形成觸覺反射的先決條件，這一研究結(jié)果為創(chuàng)面觸覺的恢復(fù)提供了理論依據(jù)，對探索觸覺功能的恢復(fù)或神經(jīng)的完美再生提供了新的可能性。神經(jīng)再生后可分泌多種內(nèi)分泌物質(zhì)，神經(jīng)肽P物質(zhì)就是其中一種，可反作用于受傷創(chuàng)面，加速創(chuàng)面愈合[19-20]。創(chuàng)面的有效愈合為神經(jīng)再生提供空間，兩者相互促進(jìn)。MEBO是以蜂蠟加麻油為基質(zhì)的一種中草藥膏，用于創(chuàng)面主要是起到隔絕的作用，使得創(chuàng)面與外界不直接接觸從而降低感染率，除此之外還有增強局部抗感染的能力。有研究指出，MEBO促進(jìn)創(chuàng)面的愈合過程極為復(fù)雜，除了提供再生愈合局部微環(huán)境還提供某些促生長物質(zhì)，創(chuàng)面愈合中有雙向調(diào)節(jié)作用[21]，早期可以促使創(chuàng)面“生肌”，晚期尚可抑制膠原蛋白的過度沉積及細(xì)胞增殖，從而有效地防止創(chuàng)面增生性瘢痕的形成。縱使MEBO在創(chuàng)面修復(fù)方面報道甚多，但在創(chuàng)面神經(jīng)再生方面的相關(guān)基礎(chǔ)研究卻也罕見。

本實驗從設(shè)計到完成，各個環(huán)節(jié)均在國內(nèi)外創(chuàng)面神經(jīng)再生相關(guān)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行。實驗通過SD大鼠足底機械創(chuàng)面模型，用乳鼠提取的原代默克爾細(xì)胞局部注射，聯(lián)合MEBO濕潤燒傷膏外敷換藥，利用MEBO的提供的“局部微環(huán)境”為創(chuàng)面的愈合過程保駕護(hù)航，并以此觀察大鼠足底創(chuàng)面的愈合及創(chuàng)面神經(jīng)再生情況。從實驗結(jié)果可以看出MCs+MEBO組及MEBO組在創(chuàng)面愈合的時間上均優(yōu)于其他實驗組，這兩組在實驗的第14天時都已基本愈合，愈合率明顯高于其他各實驗組。在建模后的第7、 14、21天三個時間點實驗組的創(chuàng)面愈合率高于對照組，又以MCs+MEBO組愈合率最高。在縮足反射對比上，MCs+MEBO組縮足反射幅度及縮足百分比均明顯強于其他各組。從免疫熒光結(jié)果分析創(chuàng)面皮膚神經(jīng)再生情況，MCs+MEBO組明顯優(yōu)于MCs組、MEBO組及PBS組，與mNGF組(陽性對照組)相近。從整個實驗結(jié)果分析可以得出，Merkel細(xì)胞局部注射聯(lián)合MEBO外用可促進(jìn)大鼠足底創(chuàng)面皮膚神經(jīng)的再生。