張良，周進(jìn)學(xué)，肖騰#，向宏市

1鄭州頤和醫(yī)院普外科，鄭州450000

2河南省腫瘤醫(yī)院普外科，鄭州4500000

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原 發(fā)性肝癌的90%以上，是中國較常見的惡性腫瘤之一[1]。早期診斷是HCC治療的先決條件[2]。臨床上，HCC的檢測(cè)主要基于血清甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）、病變活檢及各種成像技術(shù)。然而，這些HCC監(jiān)測(cè)和診斷技術(shù)仍存在一些限制[3]。因此，新生物標(biāo)志物的探究對(duì)于改善早期HCC的診斷具有十分重要的臨床意義。腫瘤患者血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞游離DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）作為生物標(biāo)志物，已廣泛用于預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)、診斷疾病和預(yù)測(cè)預(yù)后。表觀遺傳學(xué)的改變?cè)谌祟惸[瘤的發(fā)生、進(jìn)展中起著重要作用。腫瘤中最常見的表觀遺傳變化為基因啟動(dòng)子區(qū)域中的異常DNA甲基化，可導(dǎo)致腫瘤抑制基因的沉默。相關(guān)研究證實(shí)，DNA甲基化改變可作為腫瘤的生物標(biāo)志物用于早期檢測(cè)包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤。血清性別決定區(qū)域Y框蛋白1（sex-determining region Y-box protein 1，SOX1）和波形蛋白（vimentin，VⅠM）基因啟動(dòng)子甲基化可能是卵巢癌和結(jié)直腸癌的潛在預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物，且已在HCC組織中檢測(cè)到SOX1基因和VIM基因的異常甲基化。然而，HCC患者血清中SOX1基因和VIM基因啟動(dòng)子甲基化作用尚不清楚。因此，本研究對(duì)HCC患者血清SOX1基因和VIM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估，以探究其作為生物標(biāo)志物用于診斷HCC的潛在價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年1月至2016年6月于鄭州頤和醫(yī)院和河南省腫瘤醫(yī)院確診的HCC患者60例作為研究組（HCC組）。所有HCC患者術(shù)前均未進(jìn)行抗腫瘤等其他治療，且均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為HCC，血清乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HbsAg）均呈陽性。其中男性36例，女性24例；年齡30～70歲，平均（49.29±13.71）歲；臨床分期根據(jù)《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》[4]：Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期36例；分化程度：高分化18例，中分化17例，低分化25例；無包膜侵犯32例，有包膜侵犯28例；伴轉(zhuǎn)移（包括肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝外轉(zhuǎn)移）25例，不伴轉(zhuǎn)移35例；伴肝硬化41例，不伴肝硬化19例；術(shù)前檢測(cè)AFP≥20 μg/L記為陽性：陽性42例，陰性18例。選取同期于鄭州頤和醫(yī)院和河南省腫瘤醫(yī)院治療的乙型肝炎后肝硬化（liver cirrhosis，LC）患者50例（LC組）、慢性乙型病毒性肝炎（chronic viral hepatitis type B，CHB）患者50例（CHB組）作為疾病對(duì)照組，診斷均符合2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》[5]，排除乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒重疊感染和人類免疫缺陷病毒混合感染者。另外，選取同期于鄭州頤和醫(yī)院和河南省腫瘤醫(yī)院體檢的健康體檢者50例作為健康對(duì)照組（Control組），排除患其他肝臟疾病及其他重要軀體疾病的患者。4組研究對(duì)象的年齡、性別等基線資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性（表1）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有對(duì)象均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。

表1 4組對(duì)象的基線資料

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集和DNA提取 采集所有患者治療前及健康體檢者的清晨空腹外周靜脈血8 ml，置于EDTA抗凝管中，3000 r/min離心10 min后，分離血清。采用血清游離DNA提取試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)操作提取DNA，將血清DNA洗脫并于-20℃保存。

1.2.2 DNA亞硫酸鹽修飾 采用EpiTect Bisulfite Kit試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書對(duì)DNA進(jìn)行相關(guān)操作。取血清 DNA 2 μg 加入 4 mol/L NaOH，調(diào)整DNA終濃度為0.2 mol/L，于37℃變性10 min。加入30 mol/L NaHSO3，于50℃水浴16 h，經(jīng)DNA純化試劑盒修飾后，于室溫下加入4 mol/L NaOH，調(diào)整DNA終濃度為0.3 mol/L，靜置20 min脫硫。加入1/10體積乙酸鈉和冰乙醇使DNA沉淀，干燥后加入TE（pH=8.0）溶解。將修飾的DNA作為甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylmion specific polymerase chain reaction，MSP）模板，于-20℃儲(chǔ)存。

1.2.3 MSPMSP引物序列由上海生工生物工程有限公司合成（表2）。采用25 μl聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)體系：Premix Taq 12.5 μl，ddH2O 10.5 μl，正向引物和反向引物各0.5 μl、亞硫酸鹽修飾的DNA 1 μl。在ABⅠ7500型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，第一輪PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃引物延伸40 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍后，取1 μl進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，65℃退火40 s，72℃引物延伸40 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，產(chǎn)物4℃保存。以人HCC細(xì)胞系（HepG2細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫）DNA作為陽性對(duì)照（PC），以健康者外周血淋巴細(xì)胞DNA作為陰性對(duì)照（NC），以H2O代替DNA作為空白對(duì)照（Blank）。取7 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，采用JS-3000凝膠成像系統(tǒng)分析儀采集圖像。

表2 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

甲基化引物擴(kuò)增出條帶，或者甲基化與非甲基化引物均擴(kuò)增出條帶，則血清SOX1基因或VIM基因啟動(dòng)子甲基化陽性；甲基化引物未擴(kuò)增出條帶而非甲基化引物擴(kuò)增出現(xiàn)條帶，則血清SOX1基因或VIM基因啟動(dòng)子甲基化陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0-軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用F檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中SOX 1、VIM基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)結(jié)果

4組對(duì)象的SOX1、VIM基因啟動(dòng)子甲基化陽性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；其中HCC組患者的血清SOX1、VIM基因啟動(dòng)子甲基化陽性率均高于LC組、CHB組和Control組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LC組和CHB組患者的血清SOX1、VIM基因啟動(dòng)子甲基化陽性率均高于Control組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；LC組患者的血清SOX1、VIM基因啟動(dòng)子甲基化陽性率均高于CHB組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表3 不同組別血清SOX 1、VIM基因啟動(dòng)子甲基化陽性率的比較[ n（%）]

2.2 SOX 1、VIM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與HCC患者臨床特征的關(guān)系

不同包膜侵犯程度、分化程度、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況HCC患者的血清SOX1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.641，P=0.006；χ2=8.871，P=0.012；χ2=7.797，P=0.005；χ2=7.636，P=0.006）；但不同年齡、性別、腫瘤直徑、AFP水平、肝硬化、門靜脈癌栓HCC患者的血清SOX1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同分化程度、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況HCC患者的血清VIM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.967，P=0.002；χ2=5.926，P=0.015；χ2=10.080，P=0.001）；但不同年齡、性別、腫瘤直徑、AFP水平、肝硬化、門靜脈癌栓、包膜侵犯程度HCC患者的血清VIM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表 4）

表4 不同臨床特征HCC患者血清SOX 1、VIM基因啟動(dòng)子甲基化情況（ n=60）

3 討論

腫瘤發(fā)生不同階段的CpG島異常高甲基化是導(dǎo)致腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG）功能障礙的重要原因?；騿?dòng)子的超甲基化可以是早期或晚期事件中HCC的標(biāo)志物[6]。多種血清DNA的異常甲基化已被證實(shí)可作為評(píng)估HCC風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物，如血清Ras相關(guān)區(qū)域家族1A（Ras association domain family 1A，RASSF1A）、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）、活化蛋白C（activator protein C，APC）等[7-8]。既往研究已在HCC組織中檢測(cè)到SOX1和VⅠM的異常甲基化[9-10]。本研究證實(shí)，在HCC、LC、CHB患者血清中均可以檢測(cè)到SOX1基因和VIM基因啟動(dòng)子甲基化。既往研究表明，慢性肝炎-肝硬化-HCC是一個(gè)持續(xù)發(fā)展的過程[11]。本研究中發(fā)現(xiàn)，HCC患者血清中SOX1基因和VIM基因啟動(dòng)子甲基化陽性率高于LC患者和CHB患者，且而LC、CHB患者的血清SOX1基因和VIM基因啟動(dòng)子甲基化陽性率高于Control組患者，這種趨勢(shì)可能對(duì)疾病的進(jìn)展具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。

SOX1是SRY盒（SOX）蛋白家族成員之一，是編碼參與調(diào)控胚胎發(fā)育和細(xì)胞命運(yùn)的決定性轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，SOX1的組成型過表達(dá)可以抑制HCC細(xì)胞系的增殖、集落形成和侵襲能力，且SOX1敲減可以部分恢復(fù)這些功能，提示SOX1是HCC的重要腫瘤抑制因子[12]。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)，SOX1的異位表達(dá)可以通過干擾Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而抑制HCC生長(zhǎng)。已有研究證實(shí)，SOX1的異常甲基化與子宮頸癌和非小細(xì)胞肺癌相關(guān)[13-14]。另外有研究報(bào)道，在HCC組織中，SOX1表達(dá)下調(diào)與啟動(dòng)子甲基化之間存在負(fù)相關(guān)[15]。VIM基因編碼波形蛋白，其在維持細(xì)胞形態(tài)、穩(wěn)定細(xì)胞骨架等多種過程中起重要作用。VⅠM也參與細(xì)胞遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，既往研究表明，VⅠM參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程（EMT），而EMT是惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵途徑。另外，研究發(fā)現(xiàn)，VIM基因啟動(dòng)子異常甲基化與宮頸癌和胰腺癌密切相關(guān)[16-17]。

本研究評(píng)估血清SOX1基因和VIM基因啟動(dòng)子甲基化是否與HCC患者的臨床特征有關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SOX1基因和VIM基因啟動(dòng)子甲基化均與HCC患者的腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示SOX1基因和VIM基因啟動(dòng)子甲基化功能與HCC進(jìn)展密切相關(guān)，可能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，從而參與HCC的臨床進(jìn)展過程。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，SOX1基因啟動(dòng)子甲基化與HCC患者的包膜侵犯情況有關(guān)，推測(cè)SOX1基因啟動(dòng)子甲基化可能影響其他相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致HCC的臨床特征發(fā)生變化。以上結(jié)果表明，血清SOX1基因和VIM基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可能是HCC進(jìn)展的有效預(yù)測(cè)因子。

然而，由于本研究樣本量較少，且沒有量化HCC患者血清和組織中SOX1、VIMmRNA和蛋白表達(dá)水平，因此在后續(xù)研究中將進(jìn)一步檢測(cè)HCC患者SOX1和VIM表達(dá)與啟動(dòng)子甲基化之間的關(guān)系，以期為血清SOX1基因和VIM基因啟動(dòng)子甲基化的臨床應(yīng)用提供更充分的參考依據(jù)。

綜上所述，HCC患者血清中存在SOX1基因和VIM基因啟動(dòng)子甲基化，SOX1基因啟動(dòng)子甲基化與包膜侵犯程度、分化程度、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，VIM基因啟動(dòng)子甲基化與腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等有關(guān)，可作為HCC分子診斷和病情進(jìn)展的生物標(biāo)志物。