呂金燕，王剛#，王若雨，朱金明，姜佳寧

1大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，遼寧 大連1160010

2大連大學(xué)乳腺及消化腫瘤分子標(biāo)志物高通量篩選及靶向藥物轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116001

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體、孕激素受體以及人表皮生長(zhǎng)因子受體均表現(xiàn)為陰性的一種特殊類(lèi)型乳腺癌，具有腫瘤負(fù)荷大、惡性程度高、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移早等特點(diǎn)[1]。目前臨床上治療TNBC仍以化療為主，但因?yàn)槿狈τ行У陌邢蛑委熞约邦A(yù)后較差等特點(diǎn)，導(dǎo)致病死率較高，是目前臨床上治療的一個(gè)難點(diǎn)[2-3]。近些年臨床上發(fā)現(xiàn)采用生物學(xué)指標(biāo)對(duì)TNBC的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，可有效改善患者預(yù)后[4]。亮氨酸拉鏈EF-hand結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白1（leucine zipper/EF-handcontaining transmembrane protein 1，LETM1）是一種在人類(lèi)及酵母中都極為保守的線粒體內(nèi)膜蛋白。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，LETM1與線粒體形態(tài)的維持具有相關(guān)性，并且還是連接線粒體及核糖體L36蛋白構(gòu)成復(fù)雜復(fù)合物的錨蛋白[5-6]。近些年LETM1蛋白在線粒體功能紊亂中的作用被廣泛關(guān)注，并且推測(cè)其與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，但是有關(guān)其在腫瘤發(fā)展中的具體作用尚未闡述清楚[7]。本研究探討了LETM1在TNBC組織中的表達(dá)情況及與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年7月至2012年1月于大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受手術(shù)治療的100例TNBC患者的TNBC組織標(biāo)本，選取同期100例導(dǎo)管內(nèi)原位癌患者的導(dǎo)管內(nèi)原位癌組織標(biāo)本及其癌旁正常組織標(biāo)本，所有組織標(biāo)本均在患者手術(shù)過(guò)程中采集。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為T(mén)NBC或?qū)Ч軆?nèi)原位癌；②卡氏（Karnofsky，KPS）評(píng)分≥80分，術(shù)前均未接受過(guò)放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)明顯心、肺、肝、腎等重要臟器功能障礙者；②腫瘤侵犯腦部且未獲得有效控制者；③臨床資料不全者。TNBC患者100例，年齡27～78歲，平均（53.67±6.84）歲；TNM分期：Ⅰ期36例，Ⅱ期48例，Ⅲ期16例；有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例，無(wú)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例；所有患者均未出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移。導(dǎo)管內(nèi)原位癌患者100例，年齡 25～76歲，平均（52.82±7.13）歲。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

采用防脫片劑處理載玻片后，置于58～60℃恒溫箱中烘烤30～60 min。二甲苯脫蠟，于60℃恒溫箱中處理5 min，共3次。然后使用100%、95%、75%乙醇進(jìn)行處理，每個(gè)濃度的處理時(shí)間為3 min。采用3%H2O2室溫處理5～10 min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0）熱修復(fù)抗原，5%牛血清白蛋白封閉液封閉，LETM1兔抗人一抗（1∶50稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔ⅠgG二抗，37℃孵育20 min。滴加試劑SABC，37℃20 min。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)脂封片。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷

隨機(jī)選取5個(gè)400倍的高倍視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：0分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比＜5%；1分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為5%～25%；2分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為26%～50%；3分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比為51%～75%；4分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比＞75%。根據(jù)細(xì)胞染色程度評(píng)分：無(wú)著色為0分，輕度著色為1分，中度著色為2分，重度著色為3分。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果評(píng)分為上述兩項(xiàng)評(píng)分之和，0～1分為陰性，2～3分為弱陽(yáng)性，4～5分為中等陽(yáng)性，6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性[8]。

1.4 隨訪情況

所有患者出院后均隨訪5年，隨訪截至2017年1月30日?？偵鏁r(shí)間（overall survival，OS）為患者出院至死亡或隨訪截止時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件-對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LETM 1蛋白在 3種組織中表達(dá)情況的比較

TNBC組織中LETM1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為85%（85/100），高于導(dǎo)管內(nèi)原位癌組織的64%（64/100）和癌旁正常組織的29%（29/100），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；導(dǎo)管內(nèi)原位癌組織中LETM1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 LETM 1蛋白在 3種組織中的表達(dá)情況

2.2 LETM 1蛋白表達(dá)與TNBC患者臨床特征的關(guān)系

組織學(xué)分級(jí)為Ⅱ～Ⅲ級(jí)、臨床分期為Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TNBC患者的LETM1蛋白中等-強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率均高于組織學(xué)分級(jí)為Ⅰ級(jí)、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑和p53表達(dá)情況的TNBC患者的LETM1蛋白中等-強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 LETM 1蛋白表達(dá)與100例TNBC患者臨床特征的關(guān)系

2.3 TNBC患者OS影響因素的單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，年齡≥50歲、絕經(jīng)后、組織學(xué)分級(jí)為Ⅱ～Ⅲ級(jí)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LETM1蛋白表達(dá)為中等-強(qiáng)陽(yáng)性的TNBC患者的中位OS均短于年齡＜50歲、絕經(jīng)前、組織學(xué)分級(jí)為Ⅰ級(jí)、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LETM1蛋白表達(dá)為陰性+弱陽(yáng)性的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同腫瘤直徑、臨床分期的TNBC患者的中位OS比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

2.4 TNBC患者預(yù)后影響因素的多因素分析

多因素回歸分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和LETM1蛋白中等-強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)是影響TNBC患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）；絕經(jīng)狀態(tài)、年齡、組織學(xué)分級(jí)不是TNBC患者OS的獨(dú)立影響因素（P＞0.05）。（表4）

表3 100例TNBC患者OS影響因素的單因素分析

表4 100例TNBC患者OS影響因素的多因素分析

3 討論

目前臨床上對(duì)于乳腺癌的致病原因及具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡述清楚，但有研究顯示乳腺癌的形成是多種因素共同作用的結(jié)果，可能是在性激素和生長(zhǎng)因子共同作用下導(dǎo)致局部微環(huán)境的變化而生成[9]；也有研究表明乳腺癌的發(fā)病可能與患者的自身免疫系統(tǒng)有關(guān)，但是具體的發(fā)病機(jī)制還有待考證[10]。TNBC是一種特殊類(lèi)型的乳腺癌，預(yù)后較差，是目前臨床研究的熱點(diǎn)。臨床上有學(xué)者根據(jù)基因表達(dá)將TNBC分為6個(gè)亞型，揭示了各分型TNBC的不同分子生物學(xué)特點(diǎn)以及治療的差異，同時(shí)也顯示了此病的特殊性[11-12]。TNBC的特殊性除了表現(xiàn)在分子生物學(xué)上，還體現(xiàn)在對(duì)化療以及靶向治療反應(yīng)的差異性上，TNBC較非TNBC對(duì)化療以及新輔助化療更為敏感，只有部分TNBC患者能達(dá)到病理學(xué)緩解以及良好的預(yù)后，并且化療和新輔助化療對(duì)哪種類(lèi)型的TNBC患者最為敏感還尚未十分清楚[13-15]。因此尋找合適的TNBC治療方法以及特異性靶點(diǎn)是目前臨床研究的熱點(diǎn)。為此本研究探索了LETM1蛋白與TNBC患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。

LETM1蛋白在人體多種組織中均有較為廣泛的表達(dá)，其是EF臂鈣離子結(jié)合蛋白的家族成員之一。LETM1蛋白表達(dá)水平的改變可引起線粒體功能紊亂，與人類(lèi)多種疾病的發(fā)生密切關(guān)聯(lián)。線粒體合成的LETM1蛋白是調(diào)節(jié)人類(lèi)腫瘤的重要蛋白。研究表明，在人類(lèi)多種腫瘤中出現(xiàn)LETM1蛋白表達(dá)水平的顯著升高，例如肝癌[16-17]、乳腺癌[18]等，這些研究均證明了LETM1蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，TNBC組織中LETM1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于導(dǎo)管內(nèi)原位癌組織和癌旁正常組織（P＜0.05），導(dǎo)管內(nèi)原位癌組織中LETM1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常組織（P＜0.05）。提示LETM1蛋白能反映腫瘤的進(jìn)展情況，為腫瘤的早期治療提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，組織學(xué)分級(jí)為Ⅱ～Ⅲ級(jí)、臨床分期為Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TNBC患者的LETM1蛋白中等-強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率均高于組織學(xué)分級(jí)為Ⅰ級(jí)、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示TNBC患者中LETM1蛋白表達(dá)水平升高可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲力與轉(zhuǎn)移力增強(qiáng)。但不同年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑和p53表達(dá)情況的TNBC患者的LETM1蛋白中等-強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示LETM1蛋白可能是一種全新、有效的分子靶點(diǎn)。經(jīng)單因素與多因素分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和LETM1蛋白中等-強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)是影響TNBC患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），證明了LETM1蛋白對(duì)TNBC預(yù)后的重要性。

綜上所述，LETM1蛋白可作為臨床上判斷TNBC惡性程度的指標(biāo)，是影響TNBC患者預(yù)后的重要因素，可作為T(mén)NBC患者預(yù)后預(yù)測(cè)的有效指標(biāo)之一，有望成為T(mén)NBC患者潛在的生物學(xué)指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。