汪琦，王紫薇，趙曉娟，李丹，曹嘉悅，馬丹，曾靜

(北京檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京,100026)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)屬革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢桿菌，在自然界中分布廣泛，是引起各種動(dòng)物壞死性腸炎、腸毒血癥和創(chuàng)傷性氣性壞疽的主要病原菌之一[1-2]。人食用了受該菌污染的食品，可能會(huì)發(fā)生食物中毒事件，出現(xiàn)腹瀉腹痛、嘔吐、不適等急性胃腸炎癥狀[3-4]。因此，快速準(zhǔn)確鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)于有效防止該菌的污染及污染后病癥的防治具有重要意義。

目前，產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離和鑒定主要采取傳統(tǒng)檢測方法[5-7]，其中，最重要的生化鑒定實(shí)驗(yàn)為牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，具有特征性鑒別意義[2,6-7]。 此外，VITEK的ANC卡(生物梅里埃)和16S rRNA基因測序也常用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定[8-15]。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是新近發(fā)展起來的里程碑式的微生物快速鑒定技術(shù)。通過將待測微生物的特征蛋白指紋圖譜與已知微生物的特征蛋白指紋圖譜比對(duì)實(shí)現(xiàn)微生物的快速鑒定。相比現(xiàn)有檢測方法，該方法具有操作簡單、快速、高通量、準(zhǔn)確度高和成本低等優(yōu)點(diǎn)。目前，該技術(shù)已成功運(yùn)用于各種細(xì)菌和真菌的鑒定[11-13,16-19]，國內(nèi)已利用該技術(shù)對(duì)銅綠假單胞菌、溶藻弧菌、洋蔥伯克霍爾德菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等進(jìn)行了鑒定[20-23]，但在產(chǎn)氣莢膜梭菌鑒定方面的應(yīng)用還少有報(bào)導(dǎo)，只有黃永祿等用MALDI-TOF MS方法快速檢測了從地震傷員創(chuàng)面分離出的3株產(chǎn)氣莢膜梭菌[24]。

本文利用MALDI-TOF MS方法對(duì)51株產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株進(jìn)行鑒定并將鑒定結(jié)果與其他常用鑒定方法進(jìn)行比較，評(píng)估該方法是否適用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速準(zhǔn)確鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13124(A型)和ATCC12916(E型)購于美國菌種保藏中心。標(biāo)準(zhǔn)菌株CVCC1125(A型)、CVCC58(C型)、CVCC59(C型)和CVCC81(D型)購于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。51株本實(shí)驗(yàn)室保存的產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株。

1.1.2 試劑

PCR引物，上海生工生物有限公司合成；rTaq酶、dNTP，日本Takara公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，北京天根公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid， CHCA)，美國Sigma公司；細(xì)菌檢測標(biāo)準(zhǔn)品(bacterial test standard，BTS)，德國Bruker公司；甲酸，美國MREDA公司；乙腈(acetonitrile，ACN)，美國賽默飛世爾公司；三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)，美國ROE公司；無水乙醇，天津富晨；血平板，美國賽默飛世爾公司；厭氧產(chǎn)氣袋、ANC卡，法國生物梅里埃公司；液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)，北京陸橋公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Microflex LT基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，德國Bruker公司；VITEK 2 Compact，法國生物梅里埃公司；PCR儀，美國Applied Biosystems公司；Centrifuge 5424型臺(tái)式離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Friocell 222L培養(yǎng)箱，德國MMM公司；厭氧盒，日本三菱公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

將標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株劃線接種血平板，36 ℃厭氧培養(yǎng)18～ 24 h備用。

1.3.2 MALDI-TOF MS鑒定

1.3.2.1 細(xì)菌蛋白處理

常用細(xì)菌蛋白處理方式有2種，直接涂抹法和甲酸提取法。直接涂抹法：取少量新鮮培養(yǎng)物，直接涂布在靶板上，形成一均勻的薄層。待菌體干燥后，每個(gè)樣點(diǎn)覆蓋1 μL CHCA基質(zhì)溶液。干燥后上機(jī)鑒定。甲酸提取法：取適量血平板上的新鮮培養(yǎng)物，重懸于300 μL去離子水中。加入900 μL無水乙醇。渦旋振蕩后13 000×g離心2 min。倒去上清液，再次13 000×g離心1min。用槍頭吸棄上清，室溫干燥5 min。加50 ～80 μL 體積分?jǐn)?shù)為70%的甲酸溶液(甲酸的量可根據(jù)沉淀的量調(diào)整)，吹吸使沉淀充分溶解。加入等體積乙腈，渦旋振蕩后13 000×g離心2 min，取1 μL上清液點(diǎn)在靶板上，每個(gè)樣品點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)。同時(shí)點(diǎn)1 μL BTS標(biāo)準(zhǔn)品溶液用于儀器的校正。室溫干燥后每個(gè)樣點(diǎn)覆蓋1 μL CHCA基質(zhì)溶液。干燥后上機(jī)鑒定。

1.3.2.2 上機(jī)鑒定

打開FlexControl軟件，用BTS樣點(diǎn)校準(zhǔn)儀器。采集蛋白分子質(zhì)量范圍設(shè)為2 000～20 000 Da。用Biotyper RTC軟件進(jìn)行菌株圖譜信息的采集和自動(dòng)鑒定。

1.3.2.3 結(jié)果判定

布魯克MALDI-TOF MS系統(tǒng)的鑒定報(bào)告以鑒定結(jié)果和鑒定分值的形式體現(xiàn)。鑒定分值反映鑒定結(jié)果的可信度。其計(jì)算方法為在數(shù)據(jù)庫MSP中尋找待測樣品的峰，得到分?jǐn)?shù)A，在樣品圖譜中尋找數(shù)據(jù)庫MSP中的峰，得到分?jǐn)?shù)B，對(duì)比這些峰的峰高、頻率等信息，得到分?jǐn)?shù)C。A，B，C滿分為1分。鑒定分值為log10(1 000×A×B×C)。鑒定分值的判定標(biāo)準(zhǔn)為：2.300～3.000為可信的種水平的鑒定；2.000～2.299為可信的屬水平的鑒定，可能的種水平的鑒定；1.700～1.999為可能的屬水平的鑒定；0.000～1.699為不可信的鑒定結(jié)果。

1.3.3 VITEK 2 Compact系統(tǒng)鑒定

使用ANC卡進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定。用半量生理鹽水調(diào)整菌液濃度至2.8～3.3麥?zhǔn)蠁挝?，抽真空后上機(jī)鑒定。未鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌株需重復(fù)鑒定1次。

1.3.4 16S rRNA基因序列測定和比對(duì)

1.3.4.1 基因組DNA提取

從血平板上取適量的新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，- 20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 16S rRNA基因擴(kuò)增和序列比對(duì)

16S rRNA基因擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系為：10×buffer (含1.5 mmol/L MgCl2)5 μL，dNTP(2.5 mmol/L each)4 μL，rTaq酶(5 U/μL)0.2 μL，引物(10 pmol/μL)，各2 μL，DNA模板1 μL，去離子水補(bǔ)充至50 μL。16S rRNA基因擴(kuò)增引物序列為LPW58，5′-agg ccc ggg aac gta ttc ac-3′；LPW81，5′-tgg cga acg ggt gag gtt cga tac cag-3′。擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min; 94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40個(gè)循環(huán); 72 ℃ 5 min[10]。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長度約1 200 bp。經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳確定特異條帶后，送生工生物工程(上海)有限公司測序。利用Blast程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3.5 牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

按照GB4789.13的5.3.3操作。取血平板上的單克隆，接種FTG培養(yǎng)基，36 ℃厭氧過夜培養(yǎng)后取1 mL接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基。46 ℃水浴中培養(yǎng)2 h后，每小時(shí)觀察1次有無“爆裂發(fā)酵”現(xiàn)象。5 h內(nèi)不發(fā)酵者為陰性。含鐵牛乳培養(yǎng)基使用鮮牛乳配制。每個(gè)分離菌株進(jìn)行2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均為陰性的結(jié)果記為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

2.1.1 樣品處理方法的選擇

對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定之前，先采用廠家提供的2種樣品處理方法(直接涂抹法和甲酸提取法)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的6株代表不同毒素類型的產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行處理，比較樣品處理方法對(duì)鑒定結(jié)果的影響，并對(duì)MALDI-TOF MS方法的鑒定效果進(jìn)行初步確認(rèn)。

結(jié)果顯示，經(jīng)2種方法處理的標(biāo)準(zhǔn)菌株都被準(zhǔn)確鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。甲酸提取法的鑒定分值全部在2.300以上，達(dá)到了可信的種水平的鑒定。直接涂抹法41.67%(5/12)的鑒定分值在2.300以上，58.33%(7/12)的鑒定分值在1.800 ～ 2.300之間(表1)，表明直接涂抹法雖然有時(shí)能得到與甲酸提取法相當(dāng)?shù)蔫b定效果，但鑒定效果不穩(wěn)定。標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13124經(jīng)甲酸提取法和直接涂抹法得到的MALDI-TOF MS圖譜見圖1。從圖譜也可看出，相比直接涂抹法，甲酸提取法得到的圖譜基線更平穩(wěn)，蛋白峰更多，重復(fù)性更好。因此，采用甲酸提取法對(duì)分離菌株進(jìn)行處理。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC13124直接涂抹法和甲酸提取法的MALDI-TOF MS圖譜Fig.1 MALDI-TOF MS spectra of the C. perfringensreference strain ATCC13124 using direct smear method andformic acid extraction method橫坐標(biāo)表示蛋白峰的荷質(zhì)比，縱坐標(biāo)表示蛋白峰的相對(duì)強(qiáng)度；A，B為直接涂抹法2次重復(fù)得到的質(zhì)譜圖；C，D為甲酸提取法2次重復(fù)得到的質(zhì)譜圖。

2.1.2 分離菌株的鑒定結(jié)果

51株分離菌株的新鮮培養(yǎng)物經(jīng)甲酸提取法處理后上機(jī)鑒定，均被鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌且鑒定分值高于2.300，達(dá)到種水平的鑒定。鑒定結(jié)果見表2。

2.2 VITEK 2 Compact鑒定結(jié)果

51株分離菌株經(jīng)VITEK鑒定，46株菌鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌，4株菌為無法鑒定(Unidentified Organism)，1株為低分辨率(Low Discrimination)。將未成功鑒定的5株菌重新純化培養(yǎng)后再次鑒定，3株鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌，2株(cp7和cp8)仍無法鑒定。比較這2株菌2次的生化反應(yīng)，結(jié)果完全相同，說明這可能是VITEK數(shù)據(jù)庫中未收錄的生化型。VITEK鑒定結(jié)果詳見表2。

2.3 16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果

51株分離菌株的DNA經(jīng)PCR后都可以擴(kuò)增出大小約為1 200 bp的目的片段。將測序所得序列在NCBI中做Blast比對(duì)，結(jié)果均為產(chǎn)氣莢膜梭菌(表2)。

2.4 牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，32株菌2次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果皆為陽性，15株菌2次實(shí)驗(yàn)中有1次結(jié)果為陽性，4株菌(cp18，cp27，cp38和cp41)2次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性。這4株菌的16S rRNA測序、VITEK和MALDI-TOF MS 3種方法的鑒定結(jié)果均為產(chǎn)氣莢膜梭菌(表2)。

表2 51株分離菌株的MALDI-TOF MS、16S rRNA序列比對(duì)、VITEK 2 Compact和牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Identification results of the 51 isolated C. perfringens strains using MALDI-TOF MS, 16S rRNA sequencing,VITEK 2 Compact and iron-milk presumptive test

注：+代表牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽性；-代表牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陰性。

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種重要的致病菌，引起細(xì)菌性食物中毒的數(shù)量在美國排第2位[25-26]。在我國，生的肉制品、水產(chǎn)品中也存在較嚴(yán)重的產(chǎn)氣莢膜梭菌污染[3,27]。因此，快速準(zhǔn)確的鑒定方法對(duì)于產(chǎn)氣莢膜梭菌的日常檢測具有重要意義。

本文中，用新近發(fā)展起來的MALDI-TOF MS方法鑒定了實(shí)驗(yàn)室保存的51株產(chǎn)氣莢膜梭菌，并將鑒定結(jié)果與16S rRNA基因序列比對(duì)方法、VITEK方法和牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等3種常用方法進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VITEK和牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌時(shí)都出現(xiàn)了假陰性的結(jié)果，用MALDI-TOF MS方法鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌更加準(zhǔn)確(表2)。

VITEK 2鑒定梭菌屬細(xì)菌時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性的結(jié)果在多篇文獻(xiàn)中已有報(bào)道。AlMogbel用MALDI-TOF MS方法和VITEK2鑒定梭菌屬的144株菌并以16S rRNA測序方法為參考，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16S rRNA測序鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌的97株菌中，95株被MALDI-TOF MS方法鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌，而VITEK 2只鑒定出78株。VITEK 2對(duì)144株梭菌屬細(xì)菌鑒定的正確率為77.7%(112/144)，錯(cuò)誤率為9.7%(14/144)，12.5%(18/144)的菌無法鑒定[11]。有些研究報(bào)道的VITEK 2鑒定梭菌屬細(xì)菌的正確率甚至更低，只有44.4%和64.3%[8-9]。

樣品處理方式會(huì)影響MALDI-TOF MS方法的鑒定結(jié)果。CHEAN用布魯克的MALDI-TOF MS系統(tǒng)對(duì)52株梭菌屬的菌株，包括30株產(chǎn)氣莢膜梭菌和22株梭菌屬的其他菌種進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明直接涂抹法處理后鑒定正確率只有69.2%，而甲酸提取法處理后鑒定正確率為100%[12]。本實(shí)驗(yàn)中，也采用這2種常見的樣品處理方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行處理，鑒定結(jié)果表明，樣品處理方法對(duì)鑒定結(jié)果的影響主要體現(xiàn)在鑒定分值上。直接涂抹法操作簡單，雖然有時(shí)也可以得到2.300以上的鑒定分值，但是由于涂抹的菌量和均勻程度很難把握，直接導(dǎo)致采集到的圖譜質(zhì)量不穩(wěn)定，鑒定分值的差異較大(表1和圖1)。總體來說，甲酸提取法的鑒定結(jié)果在穩(wěn)定性和重復(fù)性上都高于直接涂抹法。選用甲酸提取法可以保證MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確。

除了準(zhǔn)確性，在檢測成本和速度上，MALDI-TOF MS方法也具有不可比擬的優(yōu)勢。VITEK檢測1個(gè)菌株的成本在30～40元左右，大約需要8 h。而且在檢測前需要對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色從而選擇相應(yīng)的檢測卡。而MALDI-TOF MS方法不需要知道菌株的相關(guān)信息，檢測1個(gè)菌株的成本大約為1～2元，0.5 h內(nèi)可以得到鑒定結(jié)果。與傳統(tǒng)的牛乳洶涌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)相比，MALDI-TOF MS方法不僅檢測時(shí)間大大縮短，從6～7 h縮短至0.5 h內(nèi)，而且結(jié)果穩(wěn)定，便于判斷。由于成本低，操作簡單，在實(shí)際檢測過程中，還可以通過篩選更多的可疑菌落提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上，相比傳統(tǒng)檢測方法，MALDI-TOF MS方法操作更簡便、成本更低廉，檢測時(shí)間更短，而且結(jié)果更加準(zhǔn)確，可以作為產(chǎn)氣莢膜梭菌日常檢測的有效工具。