江鵬，湯斌

1(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖，241000) 2(微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖，241000)

蚓激酶(Lumbrokinase，LK)是從蚯蚓體內發(fā)現(xiàn)的一組同時具有纖溶活性和激酶活性的絲氨酸蛋白酶[1]。該酶能夠刺激纖溶酶原轉變成纖溶酶，從而催化纖維蛋白，起到溶血栓作用[2]。臨床試驗表明，蚓激酶還可用于預防和治療冠心病、腦梗塞、肺心病和下肢深靜脈血栓等疾病[3-4]。該酶穩(wěn)定性良好，酶制劑既能口服，亦可注射，已得到廣泛應用[5-6]。目前，市售蚓激酶主要來源于蚯蚓粉末的提取純化，此法所得產品純度較低且產量少。因此，通過異源表達生產高純度的蚓激酶已成為未來蚓激酶工業(yè)化生產的趨勢[7]。

近年來，研究者已從不同種類蚯蚓中克隆得到蚓激酶編碼基因，并在大腸桿菌中進行表達，但目的蛋白多以包涵體形式存在，因而沒有纖溶活性[8-11]。相較于原核表達系統(tǒng)，畢赤酵母表達系統(tǒng)具有胞外分泌且易于純化目的蛋白的優(yōu)勢[12-14]。趙明明[15]等首次在畢赤酵母中成功表達了蚓激酶F238基因，酶活最高為100 U/mL。隨后，宋馨宇[16]等人通過G418抗性梯度篩選獲得1株耐高抗性的GS115-pPIC9K-F238菌株，搖瓶培養(yǎng)84 h后達蚓激酶酶活峰值257.6 U/mL。然而，目前蚓激酶在畢赤酵母中表達研究的報道較少，且表達量較低，遠不能應用于工業(yè)化生產[15-16]。

為了提高蚓激酶在畢赤酵母表達系統(tǒng)中的產量，本文從重組菌誘導表達條件出發(fā)，優(yōu)化初始菌體量、pH和溫度，并研究氨基酸對蚓激酶在酵母中表達的影響，最終通過高密度發(fā)酵手段實現(xiàn)蚓激酶基因在畢赤酵母中的大量表達，為今后蚓激酶的工業(yè)化生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蚯蚓樣本：獲自校園土壤中，經本實驗室分子生物學鑒定為赤子愛勝蚓。本文所用E.coliJM109、畢赤酵母GS115、pPIC9K質粒均為安徽工程大學微生物發(fā)酵研究中心保藏菌種，pMD18-T載體購自上海Sangon公司。Trizol試劑、尿激酶、購自上海Sangon公司，牛血纖維蛋白原、凝血酶購自Sigma公司，其他試劑購自國藥。

1.2 蚓激酶基因的克隆及表達

利用Trizol法提取赤子愛勝蚓總RNA，試劑盒法反轉錄合成cDNA。通過GenBank數(shù)據(jù)庫搜索蚓激酶編碼序列，經比對分析設計引物對Primer 1-F+Primer 1-R。以cDNA為模板克隆目的基因，并將其連接pMD18-T載體，送上海生工測序。根據(jù)測序結果設計引物對Primer 2-F+Primer 2-R。PCR產物和質粒同時用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，連接后轉化E.coliJM109，篩選得到重組質粒pPIC9K-lks2送上海生工測序。引物見表1。利用SacI酶對該重組質粒進行線性化，電轉化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞，利用MD平板進行篩選，并提取轉化子基因組DNA，進行PCR驗證。挑取MD平板上的酵母單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)18 h。按1%量接種于30 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600值為2～6，離心去上清收集菌體，將菌體重懸于 30 mL BMMY 培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔24 h加體積分數(shù)0.5%甲醇進行誘導表達。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

注：下劃線為酶切位點。

1.3 蚓激酶活力測定方法

本文采用國標法[17](纖維蛋白平板法)測定蚓激酶活力：制備纖維蛋白平板，將梯度濃度的尿激酶標準品點樣于纖維蛋白平板上，放置10 min后移入37 ℃培養(yǎng)箱，保溫18 h取出測量溶圈垂直的2個直徑，并計算2個直徑的乘積，重復測定3次，求平均值。以測定不同濃度的溶圈垂直直徑乘積(A)的對數(shù)為縱坐標，標準品尿激酶濃度(C)的對數(shù)為橫坐標繪制標準曲線。線性回歸方程為：lnA=0.864lnC+2.047 7，R2=0.969 8。

1.4 蚓激酶畢赤酵母重組菌的發(fā)酵條件優(yōu)化

基礎誘導培養(yǎng)基為BMMY，誘導溫度30℃，裝液量30%，搖床轉速220 r/min，甲醇添加量體積分數(shù)為0.5%。誘導初始菌體量優(yōu)化：初始OD600分別為0.5、1、1.5、2和2.5，取發(fā)酵液上清以纖維平板法測纖溶活力。誘導pH值的優(yōu)化：在上述優(yōu)化基礎上，調整初始pH值分別為4.5、5、5.5、6、6.5和7，以纖溶活力確定最佳pH值。誘導溫度的優(yōu)化：上述優(yōu)化基礎上，設置初始溫度分別為26、28、30、32、34 ℃，同樣根據(jù)纖溶活力確定最佳誘導溫度。

氨基酸對重組菌產酶的影響：在BMMY培養(yǎng)基中分別添加體積分數(shù)為0.1%的不同種類氨基酸，對照組不加氨基酸，誘導84 h后取樣檢測酶活力。

1.5 重組畢赤酵母發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

1.5.1 種子培養(yǎng)

一級種子液：挑取MD平板上的重組菌，接于10 mL YPD中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)18 h，OD600值為12左右。

二級種子液：按1%的接種量取一級種子液接于350 mL BMGY中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600值為6～7。

1.5.2 發(fā)酵過程控制

10 L發(fā)酵罐裝液量6.5 L，培養(yǎng)基為BSM培養(yǎng)基，添加體積分數(shù)為0.1%的絲氨酸，PTM1添加量為4 mL/L培養(yǎng)基，通過氨水調節(jié)pH 5.0。將二級種子液接入發(fā)酵罐中，根據(jù)畢赤酵母表達手冊進行菌體的前期培養(yǎng)，控制DO為40%，發(fā)酵pH值為5.0，培養(yǎng)溫度30 ℃，通氣量為0.5 vvm，罐壓0.08 MPa。待菌體濕重達到200 g/L左右后，停止流加甘油。溶氧上升后，饑餓培養(yǎng)0.5 h，開始甲醇誘導。誘導過程嚴格控制甲醇流加速率使DO在40%小幅波動，氨水調節(jié)pH值控制在5.5，誘導溫度28 ℃，通氣量為0.6 vvm，罐壓控制在0.08 MPa。

1.5.3 菌體初始濃度優(yōu)化

將450 mL二級種子液離心，去上清，用100 mL BMMY培養(yǎng)基洗勻菌體，全部接入發(fā)酵罐中，取發(fā)酵液離心測得菌體濕重為3±0.5 g/L，以此為基準，通過控制加入的二級種子液的量來使得接種后發(fā)酵罐中菌體初始質量濃度分別為3±0.5、6±0.5、9±0.5和12±0.5 g/L，培養(yǎng)條件均一致。發(fā)酵過程每隔12 h取樣，測菌體濕重和蚓激酶活力。

2 結果與分析

2.1 蚓激酶基因的克隆及分析

目前在GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的蚓激酶編碼序列共有19條，其中F238基因[17-19](GeneBank No. DQ202401)的相關研究最多。本文從赤子愛勝蚓中擴增得到蚓激酶基因lks2，全長738 bp，編碼246個氨基酸(圖1-A)。比對結果顯示，lks2與F238基因同源性為99.59%，其中第136、175和398位堿基不同，導致編碼的46和59位氨基酸發(fā)生差異(圖2)。

圖1 蚓激酶基因克隆(A)、表達載體雙酶切(B)和重組菌基因組PCR(C)Fig.1 Lumbrukinase gene cloning (A), expression vectordouble enzyme cutting (B) and recombinant bacterialgenome PCR (C)

圖2 lks2基因與F238基因的差異Fig.2 The difference between lks2 gene and F238 gene

2.2 蚓激酶基因在畢赤酵母中的表達

將lks2與pPIC9k質粒相連接，雙酶切驗證結果顯示表達載體pPIC9K-lks2構建成功(圖1-B)。將該表達載體電轉化畢赤酵母，獲得重組菌GS115-pPIC9K-lks2，經轉化子基因組DNA的PCR驗證結果顯示構建成功(圖1-C)。將該重組菌進行搖瓶發(fā)酵試驗，取不同誘導時間的發(fā)酵上清適當稀釋，點樣于纖維蛋白平板。結果顯示，重組畢赤酵母的蚓激酶酶活在84 h達到峰值254.4 U/mL(圖3)。

圖3 重組菌纖溶活力測定Fig.3 Fibrinolytic activity of GS115-pPIC9K-lks2

2.3 重組菌GS115-pPIC9K-lks2的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 誘導初始培養(yǎng)條件優(yōu)化

畢赤酵母甲醇誘導過程中需要消耗大量的氧，當菌體濃度較低時培養(yǎng)基成分和供氧量充足，但隨著菌體量的增加使得培養(yǎng)基中溶氧降低，從而影響菌體代謝，因此接種量對重組菌產酶影響較大。通過調整初始OD600值來研究初始菌體量對重組菌GS115-pPIC9K-lks2的影響，不同接種量的產酶變化趨勢基本一致，達到最高酶活時間點均是誘導84 h。當OD600=1.5時，蚓激酶酶活最高，峰值為288 U/mL(圖4-A)。在此基礎上優(yōu)化誘導pH值和溫度，結果如圖4-B,C所示，最佳誘導初始pH值為5.5，最適誘導溫度為28 ℃，此條件下蚓激酶酶活峰值達364.4 U/mL。

2.3.2 氨基酸添加對重組菌產酶的影響

氨基酸是構成蛋白質的基本組成，通過添加氨基酸可在一定程度上加快目的蛋白的合成。本文在BMMY培養(yǎng)基中添加各類氨基酸，研究不同氨基酸對重組菌的產酶影響。結果如圖5所示，絲氨酸、甘氨酸和異亮氨酸的添加對重組菌產酶有促進作用，其中以絲氨酸效果最佳。添加0.1%絲氨酸后，蚓激酶酶活達到397.6 U/mL。這可能是絲氨酸在菌體代謝過程中影響了重組菌合成蛋白的能力，對外源基因表達過程起到一定的調控作用。

圖4 重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-lks2的發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of fermentation conditions for the GS115-pPIC9K-lks2

2.4 重組菌發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

在搖瓶優(yōu)化基礎上，利用10 L發(fā)酵罐對重組菌GS115-pPIC9K-lks2進行放大培養(yǎng)及高密度發(fā)酵條件研究。種子液濃度為OD600=6時進行上罐發(fā)酵，此時菌體處于對數(shù)生長期，代謝能力強，有利于擴大培養(yǎng)。由于初始菌體量對畢赤酵母蚓激酶的高效表達具有重要影響，本文對發(fā)酵罐初始菌體接種量進行了比較研究。結果如圖6-A所示，初始菌體量的增加有利于提高菌體生長速率，達到在相同時間內迅速增加菌體密度的目標。隨著菌體密度增加，蚓激酶活力迅速上升，最佳接種菌濃度為9±0.5 g/L(圖6-B)。此外，初始接種量的增加可顯著縮短發(fā)酵周期。當菌體初始濃度為9±0.5 g/L時，誘導前期培養(yǎng)時間較優(yōu)化前(3±0.5 g/L)縮短了11.5 h，蚓激酶酶活提高了1.08倍(3±0.5 g/L，蚓激酶酶活為527.8 U/mL)，達到1 098.2 U/mL。

圖5 不同氨基酸對產酶影響Fig.5 Different amino acid effect on enzyme production

圖6 發(fā)酵罐放大培養(yǎng)Fig.6 Fermentation tank amplification culture

3 討論

蚓激酶屬于絲氨酸蛋白酶，其編碼基因已經成功在細菌、真菌和動植物中實現(xiàn)表達。本文研究了蚓激酶在畢赤酵母中的異源表達，并通過誘導條件優(yōu)化及高密度發(fā)酵研究，有效提高了蚓激酶的產量并縮短了發(fā)酵周期，突破了目前畢赤酵母蚓激酶表達量低的瓶頸，具有重要的工業(yè)應用價值。

本研究通過對重組菌GS115-pPIC9K-lks2的誘導條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)誘導初始菌體密度對產酶效果影響較大。菌體密度過低，會導致菌體生長環(huán)境中相對甲醇量偏高，從而產生毒性影響菌體正常代謝。甲醇誘導畢赤酵母產酶過程需要消耗大量的氧氣，因此菌體密度過高會導致溶氧不足，造成菌體無法有效利用碳源維持自身生存，同樣影響產酶能力。因而，確定最佳誘導初始菌體密度對蚓激酶在畢赤酵母中的表達十分關鍵。本文在搖瓶培養(yǎng)和發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)過程中完成了最佳初始菌體量的優(yōu)化，從而顯著提升了蚓激酶的產量，為其大規(guī)模生產提供了方向。