姬中偉，陳翔，孔小勇，周新虎，毛健*

1(江南大學(xué),糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122) 2(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223800)

酒醅是白酒窖池中發(fā)酵的固體物料，含有多種營養(yǎng)物質(zhì)以及微生物代謝產(chǎn)生的非揮發(fā)性物質(zhì)等，主要包括粗淀粉、粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、氨基酸、維生素和其他微量元素等。

高級(jí)醇是3個(gè)碳以上的一元醇類物質(zhì)的總稱，具有沸點(diǎn)高、揮發(fā)性強(qiáng)的特點(diǎn)[1]。適量的高級(jí)醇一方面可以使酒體醇甜，另一方面，它還可以與酸酯化生成酯類物質(zhì)，使酒體豐滿[2]；但是，若其濃度過高，非但不能表現(xiàn)出呈香、呈味的效果，反而會(huì)給酒體帶來諸多不好的風(fēng)格，如苦、澀、沖辣等。另外，其含量過高也會(huì)對(duì)人體造成一定的危害，這是因?yàn)楦呒?jí)醇若代謝時(shí)間較長，會(huì)抑制神經(jīng)中樞，容易導(dǎo)致飲酒者深醉，出現(xiàn)“上頭”等不良體驗(yàn)[3]。總體而言，高級(jí)醇的含量要控制在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，不可過高[4]。

在固態(tài)白酒發(fā)酵過程中，高級(jí)醇由發(fā)酵原料或酵母菌體蛋白質(zhì)經(jīng)一系列生化反應(yīng)生成。降低白酒發(fā)酵過程的高級(jí)醇有多種方法，其中通過添加蛋白酶增強(qiáng)分解蛋白的能力就是方法之一，有研究報(bào)道，在固態(tài)白酒發(fā)酵中，增加蛋白酶量，增加氨基酸含量,可以減少發(fā)酵中雜醇油的生成[5]。

當(dāng)前，通過固態(tài)發(fā)酵豆粕、核桃粕、菜籽粕等原料來制備活性肽的方法已有報(bào)道[6-10]。常用的發(fā)酵菌種有枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌等[11-12]，另外，也有少數(shù)采用乳酸菌及酵母菌發(fā)酵的報(bào)道[13]，相關(guān)研究結(jié)果表明，發(fā)酵豆粕中高分子量蛋白質(zhì)含量下降，低分子蛋白質(zhì)含量提高。

白酒酒醅同樣含有較高含量的蛋白質(zhì)，江蘇洋河酒廠的芝麻香型白酒的生產(chǎn)原料中含有較高比例的豆粕，因此蛋白含量更高。本研究考慮利用高產(chǎn)酸性蛋白酶的枯草芽孢桿菌對(duì)芝麻香型白酒酒醅進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，分解蛋白制備小分子肽，為降低產(chǎn)品中的高級(jí)醇含量提供一種新的參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用濃香型和芝麻香型酒醅由江蘇洋河酒廠提供；枯草芽孢桿菌YH-1003，由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存； DPPH和ABTS試劑購自Sigma公司；其他試劑均為國藥集團(tuán)分析純?cè)噭?/p>

培養(yǎng)基：(1)種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；(2)固體平板培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨4，酵母粉2.5，瓊脂18，脫脂奶粉12；(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米粉40，豆粕粉30，麩皮30，Na2HPO44，K2HPO40.3。上述培養(yǎng)基在121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Amicon Ultra-15超濾管(3 kDa)，Millipore公司；5804R離心機(jī)，德國Eppendorf公司；K9840自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Beta 2-8 LDplus冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅主要成分的測(cè)定

參照國家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定[14-16]。酒醅水分的測(cè)定按國標(biāo)GB/T 6435—2014所述方法，即稱取酒醅后烘干至恒重，計(jì)算酒醅損失質(zhì)量與酒醅質(zhì)量的百分比；酒醅中粗蛋白含量按國標(biāo)GB 5009.5—2016中所述凱氏定氮法進(jìn)行檢測(cè)，其中換算系數(shù)為6.25；酒醅中粗淀粉含量按國標(biāo)GB/T 5009.9—2008所述酸水解方法進(jìn)行檢測(cè)，即稱取酒醅，利用石油醚和乙醇清洗后，沸水回流條件下HCl水解2 h，之后在甲基紅指示劑下由HCl溶液進(jìn)行滴定。取3份樣品作為平行樣品，結(jié)果用平均值表示。

1.3.2 枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)

(1)菌種的活化：將保存于甘油管中的枯草芽孢桿菌接種于含有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h；之后將錐形瓶中的菌種轉(zhuǎn)接至固體平板中，30 ℃倒置培養(yǎng)24 h，將長出的單菌落挑取并接種于含有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12 h后用于接種。

(2)擴(kuò)大培養(yǎng)：將活化的枯草芽孢種子培養(yǎng)液以3%接種量接種于含有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，用于酒醅固態(tài)發(fā)酵。

1.3.3 枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵酒醅的工藝流程

稱取10 g烘干的芝麻香型酒醅加入10 mL蒸餾水，混合后加入250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌15 min，冷卻后接入0.2 mL/g枯草芽孢桿菌菌液(約108CFU/mL)，30 ℃下培養(yǎng)48 h，其中每隔12 h振蕩錐形瓶1次。發(fā)酵結(jié)束后，將酒醅置于平皿中50 ℃烘干至恒重，以干物質(zhì)質(zhì)量加入相同質(zhì)量的蒸餾水，浸濕后在30 ℃下超聲萃取30 min，之后在8 000×g離心10 min，取上清液于0.45 μm濾膜過濾后，利用3 kDa超濾膜進(jìn)行超濾分離，得到的小分子肽液冷凍干燥保存。

1.3.4 酒醅固態(tài)發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)

在1.3.3固態(tài)發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、固態(tài)發(fā)酵含水量進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，其中發(fā)酵溫度選擇27、30、33、36、40 ℃、發(fā)酵時(shí)間分別為24、36、48、60、72 h，含水量選擇0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL/g。固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后，按1.3.3所述方法對(duì)小分子肽分離提取，并檢測(cè)在不同條件下得到的肽產(chǎn)品含量(直接測(cè)定超濾所得濾液中的肽濃度)。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料液比和接種量作為考察因素，以肽含量為指標(biāo)，用Design Expert 8.0.6軟件Box-Benhnken中心組合進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化中的因素和水平Table 1 Coded values of single factor in responsesurface methodology

1.3.6 酒醅肽含量

取3 mL工藝優(yōu)化后發(fā)酵的肽與3 mL 100 g/L三氯乙酸溶液混合，靜置30 min后在8 000×g離心20 min，1 mL上清液中加入1 mL堿性銅溶液后，再加入4 mL福林酚溶液，經(jīng)55 ℃水浴5 min后，于650 nm波長下檢測(cè)吸光值，檢測(cè)值代入不同濃度牛血清白蛋白繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得肽濃度[18]。

1.3.7 酒醅肽的分子質(zhì)量分布及氨基酸組成[17]

采用優(yōu)化的固態(tài)發(fā)酵工藝條件，得到酒醅肽溶液，經(jīng)三氯乙酸沉淀離心，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，利用高效液相色譜儀檢測(cè)肽的分子質(zhì)量分布，根據(jù)不同分子質(zhì)量肽標(biāo)品在液相中保留時(shí)間的不同，檢測(cè)酒醅肽的分子質(zhì)量分布，同時(shí)以不同分子質(zhì)量肽的峰面積計(jì)算不同肽的含量比例。

氨基酸檢測(cè)：將4 mL酒醅肽溶液與4 mL濃HCl混合，水解管中充N2后在120 ℃烘箱中水解24 h，之后用10 mol/L NaOH溶液中和并用蒸餾水定容至50 mL，雙層濾紙過濾后，濾液在10 000×g離心30 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用于高效液相色譜儀檢測(cè)氨基酸種類和含量。

色譜條件：色譜柱superdex peptide 10/300 GL(10 mm×300 mm) 凝膠柱; 流動(dòng)相為0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=6. 0，含有0.1 mol/L NaCl); 流速為0.7 mL/min; 柱溫25 ℃; 檢測(cè)波長214 nm。

1.3.8 酒醅肽的抗氧化活性

(1)DPPH自由基清除率[18]：以去離子水為溶劑將凍干的酒醅肽配制成溶液。取2 mL不同濃度酒醅肽溶液與2 mL DPPH溶液(0.14 mmol/L溶于乙醇)，室溫避光靜置30 min后在517 nm波長檢測(cè)吸光值，DPPH自由基清除率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A0為2 mL去離子水與2 mL DPPH溶液混合后的吸光值；A1為2 mL樣品與2 mL DPPH溶液混合后的吸光值；A2為2 mL樣品與2 mL乙醇混合后的吸光值。

(2)清除ABTS自由基[18]：將ABTS溶液與過硫酸鉀配制為ABTS·+母液，使用前稀釋至波長734 nm下吸光值為0.7左右，將0.15 mL酒醅肽溶液與2.85 mL ABTS·+溶液混合，室溫避光靜置10 min后在波長734 nm下檢測(cè)吸光值，ABTS自由基清除率按DPPH公式計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究中檢測(cè)分析數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行樣品，以平均值和方差表示，利用GraphPad Prism 7軟件繪圖。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析優(yōu)化采用Design-Expert 8.0.6軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅主要成分分析

2種酒醅在含水量和粗淀粉較為接近，而在粗蛋白含量中具有較大差異，其中，由于芝麻香型酒醅含有較高比例的豆粕，其粗蛋白含量約為13.5 g/100 g酒醅，是濃香型酒醅粗蛋白含量的2.5倍(表2)。本研究選擇芝麻香型酒醅作為固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)肽的原料。

表2兩種酒醅的主要成分含量

單位：g/100g

2.2 枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵酒醅生產(chǎn)小分子肽的單因素試驗(yàn)

利用本團(tuán)隊(duì)前期篩選得到的產(chǎn)酸性蛋白酶枯草芽孢桿菌對(duì)芝麻香型酒醅進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，并利用響應(yīng)面方法對(duì)固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)酒醅肽含量的影響

發(fā)酵溫度為27 ℃時(shí)提取得到的肽含量為4.45 mg/mL，當(dāng)發(fā)酵溫度升高至30 ℃時(shí)肽的含量達(dá)到最高為5.83 mg/mL，超過30 ℃后肽含量開始下降，在發(fā)酵溫度達(dá)到40 ℃時(shí)肽含量僅為1.02 mg/mL(圖1)?？莶菅挎邨U菌屬于細(xì)菌的一種，其生長、產(chǎn)酶能力及酶學(xué)性質(zhì)受溫度影響大。因此，在較高培養(yǎng)溫度下酒醅肽含量的降低，可能是由于在較高溫度下菌體產(chǎn)酶和所產(chǎn)酸性蛋白酶水解能力的下降，導(dǎo)致酒醅肽含量的降低。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)肽的影響Fig.1 Effect of culture temperature on peptides productionin solid state fermentation of BFG by B. subtilis

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒醅肽含量的影響

發(fā)酵時(shí)間由24 h延長至48 h時(shí)，酒醅肽含量由2.54 mg/mL增加至7 mg/mL(圖2)。在固態(tài)發(fā)酵48 h后，隨時(shí)間的增加肽含量開始下降，72 h時(shí)肽含量為4.5 mg/mL。在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，發(fā)酵時(shí)間的延長有利于蛋白酶水解產(chǎn)生肽，這主要是由于發(fā)酵時(shí)間的延長提高了發(fā)酵中的菌體量和微生物代謝產(chǎn)生的蛋白酶含量，從而有效水解固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中的蛋白質(zhì)并形成小分子肽[6]。但過多的蛋白酶積累并不利于積累肽，因?yàn)榈鞍酌傅倪^量存在將導(dǎo)致水解形成的肽再次被水解成為更小的肽或直接水解為氨基酸，因此表現(xiàn)為小分子肽含量的下降。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)肽的影響Fig.2 Effect of culture time on peptides production insolid state fermentation of BFG by B. subtilis

2.2.3 含水量對(duì)酒醅肽含量的影響

含水量為0.6 mL/g時(shí)酒醅肽含量最低，為2.48 mg/mL，當(dāng)含水量由0.6 mL/g提高至1.2 mL/g時(shí)，肽含量隨之增加，在1.2 mL/g時(shí)肽含量達(dá)到最高的6.42 mg/mL，之后開始下降(圖3)。

圖3 含水量對(duì)枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)肽的影響Fig.3 Effect of moisture on peptides production insolid state fermentation of BFG by B. subtilis

2.3 酒醅固態(tài)發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果，按照表3中所述條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

得到酒醅肽含量(Y)對(duì)發(fā)酵溫度(X1)、發(fā)酵時(shí)間(X2)和含水量(X3)之間的多元回歸方程為：

Y=-180.292+9.016X1+1.210X2+41.794X3-0.013X1X2+0.246X1X3-0.083X2X3-0.146X12-0.007X22-19.375X32

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design with experimental andpredicted T-AOC values

2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

表4 回歸方程各項(xiàng)方差分析Table 4 Analysis of variance for the response surfacequadratic model

2.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)的理論值及驗(yàn)證試驗(yàn)

利用三維曲面分析了發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和含水量三條件之間的交互影響，結(jié)果顯示發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的交互影響最為顯著。通過響應(yīng)面的分析在選定的條件范圍內(nèi)，適當(dāng)提高三因素的水平可有效提高酒醅肽的得率。通過對(duì)多元回歸方程求解，得到酒醅固態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)條件為：發(fā)酵溫度29.84 ℃、發(fā)酵時(shí)間46.83 h、含水量1.19 mL/g，此條件下酒醅肽含量預(yù)測(cè)值為7.24 mg/mL。在驗(yàn)證試驗(yàn)中，本研究將發(fā)酵條件調(diào)整為：發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時(shí)間47 h、含水量1.2 mL/g。在此條件下發(fā)酵并提取得到的酒醅肽含量為7.06 mg/mL，相對(duì)誤差約為3.74%，對(duì)比未優(yōu)化前對(duì)照條件下的5.83 mg/mL，酒醅肽含量提高了1.2倍。因此，本研究利用響應(yīng)面優(yōu)化方法有效提高了酒醅肽的產(chǎn)量。

2.4 酒醅肽的分子質(zhì)量分布與氨基酸組成

酒醅肽在液相中根據(jù)保留時(shí)間的不同可以分成7個(gè)峰，其中分子質(zhì)量在2 000～1 000 Da和1 000～500 Da的肽占比分別為41.56%和15.05%(表5)。此外還含有少量高于2 000 Da的肽，但在酒醅肽溶液中含量較少，占比約為10%左右。在肽樣品中同樣檢測(cè)到分子量較低的樣品(<180 Da)，這部分樣品可能主要是被過量水解而積累的氨基酸。

本研究還對(duì)酒醅肽中的氨基酸組成及含量進(jìn)行了檢測(cè)和分析。在檢測(cè)到的17種氨基酸中(圖4)，含量最高的是谷氨酸(Glu)，達(dá)到1 970 mg/L，其次是含量為1 274 mg/L的天冬氨酸(Asp)，含量在500～800 mg/L范圍內(nèi)的氨基酸包括精氨酸(Arg)為745.6 mg/L、亮氨酸(Leu)為696.2 mg/L和酪氨酸(Tyr)為516.1 mg/L。人體必需8種氨基酸中，苯丙氨酸(Phe)和甲硫氨酸(Met)含量較低，分別為2.88和11.88 mg/L，其余6種氨基酸含量在200～800 mg/L范圍內(nèi)。

圖4 酒醅肽中的氨基酸種類和含量Fig.4 The composition and content of amino acids inpeptides produced from Baijiu Fermenting Grains

2.5 酒醅肽的抗氧化活性

酒醅肽質(zhì)量濃度在0.3 mg/mL以上時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除能力要明顯高于ABTS自由基(圖5)。在考察DPPH自由基清除能力時(shí)，當(dāng)酒醅肽質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到85.5%，之后清除率保持穩(wěn)定直至最高肽質(zhì)量濃度(0.6 mg/mL)；而ABTS具有相似的清除能力趨勢(shì)，在0.4 mg/mL時(shí)酒醅肽對(duì)ABTS自由基清除率為66.2%，之后基本保持穩(wěn)定。

圖5 不同質(zhì)量濃度酒醅肽的DPPH和ABTS自由基清除率Fig.5 DPPH and ABTS radical scavenging activity ofvarious concentrations of BDG peptides

酒醅肽的抗氧化活性與其分子質(zhì)量分布及氨基酸組成密切相關(guān)。豆粕固態(tài)發(fā)酵所得到的分子質(zhì)量在2 kDa以下的小肽具有較高的抗氧化活性[19]。另外，本研究所得到的酒醅肽中酪氨酸、賴氨酸等氨基酸含量較高，這些氨基酸本身就具有較強(qiáng)的抗氧化能力[20]。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，肽含量最高可達(dá)到7.04 mg/mL，同時(shí)酒醅肽分子質(zhì)量較多分布在低于2 000 Da，較低分子質(zhì)量可能是酒醅肽具有良好自由基清除能力的原因，在0.4 mg/mL下對(duì)DPPH和ABTS自由基具有良好的清除率，顯示了良好的抗氧化活性。本研究結(jié)果表明，芝麻香型酒醅在固態(tài)發(fā)酵的條件下能夠產(chǎn)生具有抗氧化活性的小分子肽，這為降低酒醅蛋白含量從而調(diào)控產(chǎn)品中的高級(jí)醇提供了一種參考的途徑。