劉雨露 ，王華廣 ，杜建輝， 唐蕾,*

1 (江南大學，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2 (江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

木聚糖酶是一類可以水解木聚糖為木寡糖和木糖的酶系，β-1,4-D內(nèi)切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是木聚糖水解過程中的關(guān)鍵酶，它能夠水解木聚糖骨架中的β-1，4-木糖苷鍵[1]。根據(jù)氨基酸序列的相似性，木聚糖酶主要分為糖苷水解酶 (glycosyl hydrolase, GH) 10和11兩大家族。木聚糖酶在食品、紡織、造紙、飼料、生物能源等工業(yè)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用前景[2]。然而，在工業(yè)應(yīng)用中，經(jīng)常需要一些具有特殊性質(zhì)的木聚糖酶來滿足不同的需求，如耐高溫、耐酸、耐堿等。因此，挖掘和開發(fā)一些新種類的木聚糖酶十分必要。當前木聚糖酶的來源主要是通過微生物發(fā)酵法制備。然而，在微生物發(fā)酵過程中，由于一些微生物產(chǎn)生的木聚糖酶量少，酶活低，成分復雜，使得一些特定的木聚糖酶難以分離純化，限制了木聚糖酶在工業(yè)中的應(yīng)用。近年來，已有多種不同來源的木聚糖酶通過分子克隆技術(shù)在大腸桿菌、酵母等多種宿主中進行了異源表達。如來源于黑曲霉的木聚糖酶XynB和XynC分別成功地在大腸桿菌與畢赤酵母中進行了表達[3-4]。來源于Clostridiumsp.的木聚糖酶也有較多在大腸桿菌或酵母中進行了異源表達[5-7]。其中，也有部分木聚糖酶是直接從復合菌系中利用分子克隆的方法獲得，如來源于復合菌系中的木聚糖酶Xyn3F以及木聚糖酶Xyn2441[8-9]。

本課題組在前期的研究中，構(gòu)建了一組可以高效水解酒精發(fā)酵后木薯渣的復合菌系RXS，并鑒定出1種關(guān)鍵菌株為Clostridiumclariflavum[10]。C.clariflavum作為一種嗜熱厭氧微生物，有較豐富的木質(zhì)纖維素降解酶系[11]，對于木質(zhì)纖維素的降解具有巨大的應(yīng)用潛能，其全基因組序列于2012年公布[12]。目前，C.clariflavum中許多蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能并未確定。前期，對全基因組序列進行分析，發(fā)現(xiàn)了一種新的可以編碼多個結(jié)構(gòu)域的木聚糖酶基因Clocl-2083(結(jié)構(gòu)域為GH11-GH10-Dockerin Ι) (ID:11562500)，表達的木聚糖酶Xyn2083為一種雙功能的木聚糖酶，包括2個催化結(jié)構(gòu)域GH11、GH10[12-13]。

C.clariflavum作為厭氧微生物，產(chǎn)生的酶系較為復雜，且表達的木聚糖酶Xyn2083量較少[13]。因此，本實驗通過分子克隆技術(shù)將Xyn2083及不同截短的木聚糖酶在大腸桿菌中進行異源表達，成功得到了具有活性的可溶性蛋白，將純化后的重組酶進行了酶學性質(zhì)研究，并探究了這種木聚糖酶的催化結(jié)構(gòu)域中GH11與GH10在底物水解中的作用，為其在大規(guī)模工業(yè)化中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

C.clariflavum為復合菌系RXS中的一種關(guān)鍵菌株，復合菌系RXS由本實驗室保藏。大腸桿菌JMl09、Rosetta (DE3)、質(zhì)粒pET28a(+)均由本實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑

菌株構(gòu)建所用的限制性內(nèi)切酶(BamH I 和NotI)、T4DNA連接酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶購買于TaKaRa公司。定量所需的木寡糖標準品購買于青島博智匯力生物科技有限公司。Super-Bradford蛋白定量試劑盒購買于康為世紀生物科技有限公司。山毛櫸木聚糖購買于愛爾蘭的Megazyme公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

AKTA AVANT25蛋白純化儀，美國GE公司；SPECTRAMAX 0200-3850酶標儀，美國Molecular Devices公司；UltiMate 3000高效液相色譜儀，美國戴安有限公司；HPLC色譜柱Bio-Rad Aminex HPX-87H column (7.8 mm×300 mm)。

1.3 方法

1.3.1 目的基因的克隆和重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以復合菌系RXS的總基因組為模板，利用National Center for Biotechnology Information (NCBI)數(shù)據(jù)庫獲得木聚糖酶Xyn2083(ID:11562500)的全長及不同結(jié)構(gòu)域的核酸序列，設(shè)計引物，進行異源表達(表1)，構(gòu)建3種重組質(zhì)粒，結(jié)構(gòu)域的組成如圖1所示。目的基因的克隆和重組質(zhì)粒的構(gòu)建均按照之前的實驗方法[9]。其中，以大腸桿菌Rosetta (DE3)作為表達宿主。

表1 Xyn2083和不同截短木聚糖酶基因擴增引物Table 1 Primers used for amplification of the genes of Xyn2083 and different truncated xylanases

圖1 Xyn2083木聚糖酶結(jié)構(gòu)域組成Fig.1 Domain organization of Xyn2083 xylanases

1.3.2 重組木聚糖酶的誘導表達及分離純化

將重組菌株接種到含有100 μg/mL卡那霉素、34 μg/mL氯霉素的TB培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)，待菌體的OD600達到0.6～0.8時，加入終濃度為0.45 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)，15 ℃、200 r/min誘導表達24 h，離心收集菌體。利用磷酸鈉緩沖液重新懸浮收集的菌體，進行超聲破碎、離心收集上清作為粗酶液，粗酶液用0.22 μm水系濾膜過濾后通過1 mL his TrapTMHP進行分離純化, 并利用Sephadex G25進行脫鹽，SDS-PAGE電泳鑒定純度。

1.3.3 重組木聚糖酶活性及蛋白濃度的測定

向反應(yīng)體系中加入500 μL稀釋后的酶液與500 μL 10 mg/mL的山毛櫸木聚糖底物，在一定溫度下保溫5 min，利用DNS法檢測還原糖的釋放量[14]。每分鐘水解木聚糖底物生成1 μmol還原糖所需的酶量為1個酶活力單位(1 U)。蛋白濃度按照Super-Bradford 蛋白定量試劑盒的說明測定，以牛血清蛋白作為標準品。

1.3.4 重組木聚糖酶的酶學性質(zhì)

1.3.4.1 溫度對重組木聚糖酶活性的影響

以100 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4為緩沖溶液，在45～75 ℃范圍內(nèi)檢測酶活性，以最高酶活為100%計算相對酶活。

1.3.4.2 pH值對重組木聚糖酶活性的影響

在pH 5.0～7.5的不同pH值和最適反應(yīng)溫度下檢測重組木聚糖酶的酶活，以最高酶活為100%計算相對酶活。

1.3.4.3 溫度對重組木聚糖酶穩(wěn)定性的影響

將蛋白濃度為35 μg/mL的酶液，分別在60、65 ℃下處理不同的時間，在最適溫度和pH值下檢測剩余酶活，以處理0 h的酶活為100%計算處理不同時間的剩余酶活。

1.3.4.4 pH值對重組木聚糖酶穩(wěn)定性的影響

將蛋白濃度為35 μg/mL的酶液，在pH 3.5～11.0范圍緩沖溶液中于35 ℃下處理12 h檢測剩余酶活，以處理0 h的酶活為100%計算處理不同時間的剩余酶活。

1.3.4.5 重組木聚糖酶的動力學參數(shù)測定

以山毛櫸木聚糖為底物，在酶的最適條件下測定不同底物濃度下的初始酶活，根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖。以底物1/[S]為X軸，1/[V]為Y軸作圖擬合出線性方程，計算不同底物的Km和Vmax。

1.3.4.6 重組木聚糖酶水解產(chǎn)物的分析

以100 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4為緩沖溶液，將1U的重組酶分別加入250 μL，2 mg/mL的不同木寡糖溶液中進行水解反應(yīng)，重組酶液的體積為100 μL。利用RI檢測器，HPLC色譜柱進行水解產(chǎn)物的測定，流動相為5.0 mmol/L的稀硫酸溶液，流速為0.6 mL/min，溫度為65℃。

1.3.5 木聚糖酶Xyn2083序列分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用BLAST比對，獲得不同來源木聚糖酶的氨基酸序列，并利用DNAMAN軟件對這些氨基酸序列進行比對和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶Xyn2083序列分析

Clostridiumclariflavum全基因組序列表明，clocl-2083的一段完整開放閱讀框(ORF)有1 983個堿基，可編碼660個氨基酸，包括N端信號肽(SP)，GH11、GH10兩個催化結(jié)構(gòu)域和C端的一個Dockerin I結(jié)構(gòu)域(Doc)，氨基酸殘基的序列分別1～29, 41～222, 279～581, 600～657 (圖1)。木聚糖酶Xyn2083的C末端有一個I型的Dockerin結(jié)構(gòu)域，I型的Dockerin結(jié)構(gòu)域是纖維小體的重要組成部分，它使酶亞基通過I型dockerin-cohesin作用連接在纖維小體上[13]，這表明木聚糖酶Xyn2083屬于纖維小體酶。

分別對Xyn2083全長及其中GH11、GH10結(jié)構(gòu)域與不同來源的氨基酸序列進行比對分析。結(jié)果表明，對于多結(jié)構(gòu)域Xyn2083氨基酸序列，在目前已報道的不同來源的木聚糖酶中，沒有發(fā)現(xiàn)與Xyn2083全長氨基酸序列一致性較好的酶。然而與來源于PseudobacteroidescellulosolvensATCC 35603的木聚糖酶(KNY28459.1)進行比對，序列覆蓋率為98%，一致性為63%(圖2)，但是目前并未發(fā)現(xiàn)與該酶相關(guān)的報道。Xyn2083中單一的GH11催化結(jié)構(gòu)域與這些不同來源的GH11木聚糖酶氨基酸序列的一致性為48%～64%，推測出GH11結(jié)構(gòu)域中的2個催化氨基酸(E82和E173) (圖3)。Xyn2083中單一的GH10催化結(jié)構(gòu)域與這些不同來源的GH10木聚糖酶氨基酸序列的一致性為38%～40%，推測出GH10結(jié)構(gòu)域中的2個催化氨基酸(E107和E266) (圖4)。

2.2 木聚糖酶基因的克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以RXS的全基因組為模板進行3個不同目的基因片段的PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，電泳結(jié)果顯示不同目的基因的條帶單一(圖5)。Xyn2083、Xyn2083GH11、Xyn2083GH10的理論大小分別為2023、770、1131 bp，與電泳膠圖的位置符合。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒進行BamH I、NotI雙酶切驗證，并進一步通過核酸序列測序，其結(jié)果與Clocl-2083中不同結(jié)構(gòu)域的基因序列一致，且讀碼框正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Xyn2083：Clostridium clariflavum; Pce：Pseudobacteroides cellulosolvens ATCC 35603(KNY28459.1)圖2 Xyn2083與其他來源的木聚糖酶氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of Xyn2083 with xylanase from the other source

圖3 不同來源的GH11木聚糖酶氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of GH11 xylanases from different sourcesGH11: Clostridium clariflavum; Dth: Dictyoglomus thermophilum(PDB:1F5J); Bsu: Bacillus subtillis B230(1IGO); Cth:Chaetomium thermophilum(1H1A); Tfu: Thermobifida fusca(3ZSE)。黑色三角形為推測的GH11中E82和E173這2個催化氨基酸。

圖4 不同來源的GH10木聚糖酶氨基酸序列比對Fig.4 Amino acid sequence alignment of GH10 xylanases from different sourcesGH11: Clostridium clariflavum; Tma:Thermotoga maritime (PDB:1VBR); Sli:Sreptomyces lividans (1EOV); Sol: StreptomycesOlivaceoviridis (1V6Y);Tpe: Thermotoga petrophila (3NIY)。黑色三角形為推測的GH10中E107和E266這2個催化氨基酸。

M-DNA marker; Lane a1-Xyn2083; Lane b1-Xyn2083GH11;Lane c1-Xyn2083GH10圖5 目的基因Xyn2083(a)、Xyn2083GH11(b)、Xyn2083GH10(c) PCR擴增 Fig.5 PCR amplification of gene Xyn2083(a)、Xyn2083GH11(b)、Xyn2083GH10(c)

2.3 重組木聚糖酶的誘導表達及分離純化

將構(gòu)建的3種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta (DE3)中，在相同條件下進行誘導表達，獲得了3種具有活性的可溶性重組木聚糖酶，測得粗酶液中Xyn2083、Xyn2083GH11、Xyn2083 GH10這3種重組木聚糖的酶活分別為135.253、658.134、5.937 U/mL，比酶活分別為35.638、175.152、1.574 U/mg。這3種重組木聚糖酶在大腸桿菌中的表達主要是以可溶性的形式存在，而包涵體蛋白約為總重組木聚糖酶的2.0%，其中 Xyn2083、Xyn2083GH11、Xyn2083GH10這3種可溶性重組蛋白在粗酶液中的質(zhì)量分數(shù)分別為2.6%、 10.2%、5.7%。這種差別可能與重組蛋白中氨基酸的數(shù)量或結(jié)構(gòu)域的構(gòu)成有關(guān)。先前也有研究表明，將木聚糖酶截短后，使得酶的表達量得到了提高[15-16]。3種重組木聚糖酶的粗酶液經(jīng)鎳柱純化和脫鹽柱脫鹽處理后，利用SDS-PAGE蛋白電泳檢測重組木聚糖酶的純度。如圖6所示，3種酶純度已達到了酶學性質(zhì)分析的要求。Xyn2083、Xyn2083GH11、Xyn2083GH10的理論分子質(zhì)量分別為72.3、31.7、46.4 kDa，與目的條帶在電泳圖中的位置吻合。

M-protein marker; Lane a1-Xyn2083; Lane b1-Xyn2083GH11; Lane c1-Xyn2083GH10圖6 純化重組木聚糖酶Xyn2083(a)、Xyn2083GH11(b)、Xyn2083GH10(c)的SDS-PAGE電泳Fig.6 SDS-PAGE of recombinant xylanase Xyn2083(a)、Xyn2083GH11(b)、Xyn2083GH10(c)

2.4 重組木聚糖酶的酶學性質(zhì)

2.4.1 溫度對重組木聚糖酶的活性與穩(wěn)定性的影響

重組木聚糖酶最適反應(yīng)溫度的測定結(jié)果如圖7所示， 測得Xyn2083、Xyn2083GH11、 Xyn2083GH10分別在60、55、65 ℃反應(yīng)時相對酶活最高，酶活分別為18.451、24.834、7.290 U/mL。這表明GH11與GH10兩個催化結(jié)構(gòu)域具有不同最適反應(yīng)溫度， GH10的最適反應(yīng)溫度較高。

圖7 重組木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度Fig.7 The optimal reaction temperature forrecombinant xylanases

重組木聚糖酶溫度穩(wěn)定性的測定結(jié)果如圖8所示，Xyn2083、Xyn2083GH11、Xyn2083GH10的加酶濃度相同，均為35 μg/mL，初始酶活分別為12.897、101.824、0.731 U/mL。這3種酶在60 ℃保溫10 h時，酶的活性幾乎不變。在65 ℃下處理時，3種木聚糖酶的活性緩慢降低，保溫10 h后，Xyn2083、Xyn2083GH11木聚糖酶的活性剩余約為40%， Xyn2083GH10幾乎檢測不到酶活，這表明GH11結(jié)構(gòu)域?qū)囟饶褪苄暂^GH10好。由溫度穩(wěn)定性曲線可知，Xyn2083中GH11與GH10兩個催化結(jié)構(gòu)域在60 ℃及以下時，均具有較好的穩(wěn)定性。

圖8 重組木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性Fig.8 The thermostability for recombinant xylanases

2.4.2 pH值對重組木聚糖酶的活性與穩(wěn)定性的影響

如圖9所示，當pH值為6.0時，Xyn2083、Xyn2083 GH11、 Xyn2083GH10這3種重組酶的相對酶活最高，酶活分別為19.463、25.167、7.721 U/mL。這表明GH11與GH10兩個催化結(jié)構(gòu)域具有相同的最適反應(yīng)pH值，且在pH 5.5～6.5范圍內(nèi)其相對酶活在70%以上。對于Xyn2083，在pH值為5.5時，相對酶活較低，約為最高酶活的45%。

圖9 重組木聚糖酶的最適反應(yīng)pH值Fig.9 The optimal reaction pH for recombinant xylanases

重組木聚糖酶pH值穩(wěn)定性的測定結(jié)果如圖10所示。

圖10 重組木聚糖酶的pH值穩(wěn)定性Fig.10 The pH stability for recombinant xylanases

3種重組酶的加酶濃度相同，均為35 μg/mL。分別在其最適反應(yīng)溫度與pH值下，測得3種重組酶Xyn2083、Xyn2083GH11、 Xyn2083GH10的初始酶活分別為11.982、95.725、0.805 U/mL。 由pH值穩(wěn)定性可知，Xyn2083GH10在pH 5.0～9.0之間時比較穩(wěn)定，當在pH 9.5溶液中處理12 h后，剩余酶活約為初始酶活的75%；在pH 4.5的條件下時，剩余酶活快速下降，約為初始酶活的45%。Xyn2083GH11在pH 4.0～10.5之間都比較穩(wěn)定，當在pH值11.0溶液中處理12 h后，Xyn2083GH11的酶活還剩余約60%。這表明Xyn2083GH11比Xyn2083GH10具有更好的pH值耐受性。對于重組酶Xyn2083，在pH 4.5～10.5之間都比較穩(wěn)定，處理12 h后，剩余酶活在85%以上。一些來源Clostridiumsp.的其他木聚糖酶也有關(guān)于pH值耐受范圍的報道，但大多都有較窄的pH值耐受范圍，如來源于C.beijerinckiiG117的木聚糖酶在pH 5.0～7.0間較穩(wěn)定[17]，來源于C.acetobutylicumATCC 824在pH 5.0～6.5間較穩(wěn)定[18]。少數(shù)來源于Clostridiumsp.的木聚糖酶也具有較寬的pH值耐受范圍，如來源于C.thermocellumATCC 27405D的木聚糖酶在pH 4.0～9.0間較穩(wěn)定[15]，該酶的耐酸性與截短木聚糖酶Xyn2083GH11的酸耐受性相似，但Xyn2083與Xyn2083 GH11的堿耐受性卻強于該酶。這表明Xyn2083與大多數(shù)來源于Clostridiumsp.的其他木聚糖酶相比具有更寬的pH值耐受性，這也表明Xyn2083可在更寬泛的pH值范圍內(nèi)使用。

2.4.3 重組木聚糖酶的動力學參數(shù)

利用山毛櫸木聚糖為底物測定3種重組木聚糖酶的動力學參數(shù)。如表2所示，當以山毛櫸木聚糖為底物時，重組木聚糖酶Xyn2083GH11的kcat/Km值高于Xyn2083GH10的kcat/Km值，這表明在Xyn2083中，以高聚合度的木聚糖為底物時，GH11結(jié)構(gòu)域比GH10結(jié)構(gòu)域有更高效的水解效率。

表2 以山毛櫸木聚糖為底物時木聚糖酶的動力學參數(shù)Table 2 Substrate specificities and kinetic parameters of xylanases for the hydrolysis of beechwood xylan

2.4.4 木寡糖水解產(chǎn)物的分析

為探究雙功能木聚糖酶Xyn2083中2個催化結(jié)構(gòu)域GH11、GH10在木聚糖水解中的作用，將Xyn2083與截短木聚糖酶Xyn2083GH11、Xyn2083 GH10分別與不同聚合度的木寡糖反應(yīng)40 min后，利用HPLC對水解產(chǎn)物進行分析(圖11)。結(jié)果表明Xyn2083GH11對木四糖與木五糖的水解產(chǎn)物為木二糖與木三糖(圖11-c)。Xyn2083GH10對木寡糖的水解產(chǎn)物為木糖與木二糖(圖11-d)。Xyn2083與Xyn2083GH10的水解產(chǎn)物相似，將木寡糖水解為木糖與木二糖(圖11-b)。這表明了在Xyn2083中，GH10結(jié)構(gòu)域?qū)δ揪厶堑乃飧鼜氐?，GH11結(jié)構(gòu)域與GH10結(jié)構(gòu)域共同作用于木聚糖底物，其中GH11結(jié)構(gòu)域能夠?qū)⒏呔酆隙鹊哪揪厶撬鉃榈途酆隙鹊哪竟烟?，GH10結(jié)構(gòu)域進一步將低聚合度的木寡糖進行水解，產(chǎn)生分子量更小的水解產(chǎn)物[19]。

3 結(jié)論

Clostridiumclariflavum為嗜熱厭氧微生物，可產(chǎn)生多種木質(zhì)纖維素降解酶系，在木質(zhì)纖維素降解方面有極大的應(yīng)用潛力。目前，研究者較多的關(guān)注于C.clariflavum產(chǎn)生的復合酶系對木質(zhì)纖維素的水解作用及機制。對于單個酶的性質(zhì)及功能的有關(guān)報道較少，使得一些性質(zhì)較好的酶并未得到人們的關(guān)注， 限制了C.clariflavum在工業(yè)中的應(yīng)用。本實驗成功將雙功能木聚糖酶Xyn2083及其截短部分在大腸桿菌中表達，得到具有活性的可溶性木聚糖酶。酶學性質(zhì)表明，Xyn2083具有較寬的pH值耐受范圍，為4.5～10.5，酶活在60 ℃以下保持穩(wěn)定。最適反應(yīng)溫度與pH值分別為60 ℃、6.0。在木聚糖的水解反應(yīng)中，2個催化結(jié)構(gòu)域GH11、GH10共同作用于底物，將木聚糖水解為木糖和木二糖。具有良好的工業(yè)應(yīng)用潛能。

X1～X5:木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖圖11 HPLC分析0min(a)以及Xyn2083(b)、Xyn2083GH11(c) and Xyn2083GH10(d)水解40min時木寡糖的水解產(chǎn)物Fig.11 HPLC analysis of hydrolytic products of xylooligosaccharides released at 0 min(a), 40 min using Xyn2083(b)，Xyn2083GH11(c) and Xyn2083GH10(d)