黃筱萍, 劉蘭，熊大維，金丹鳳，黃國昌，顧斌濤，李鵬

(江西省科學院 微生物研究所，江西 南昌，330029)

2-苯乙醇(2-phenylethanol，簡稱2-PE)是一種具有玫瑰氣味的芳香醇，廣泛應用于日化、食品和醫(yī)藥領域中。2-PE和乙醇對酵母的毒性是生物轉化法生產(chǎn)2-PE中產(chǎn)物濃度不高的主要原因[1-4]。通過原位產(chǎn)物分離(in situ product removal, ISPR)技術從發(fā)酵液中萃取和吸附產(chǎn)物2-PE，維持產(chǎn)物濃度在較低水平，避免產(chǎn)物抑制，是提高2-PE產(chǎn)量的一種主要方法[5-6]。采用有機溶劑兩相萃取技術原位轉移2-PE可一定程度解決產(chǎn)物抑制效應, 有機溶劑黏度大,產(chǎn)品分離復雜，在實際生產(chǎn)應用中必然會增加發(fā)酵工藝的復雜性和成本[7-8]。ESCHMANN等在酵母細胞培養(yǎng)過程中用聚丙二醇1200作為萃取劑，有機相和水相中的2-PE產(chǎn)量分別達到26.5 g/L和0.3 g/L[9]。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加大孔樹脂進行產(chǎn)物吸附可有效提高2-PE的產(chǎn)量[10]。關昂等采用大孔樹脂F(xiàn)D0816為吸附介質，2-PE終濃度達到12.8 g/L[11]，WANG等以FD0816樹脂作為萃取劑對S.cerevisiaeGivR-UV3進行半連續(xù)培養(yǎng)，通過控制葡萄糖流量和更換發(fā)酵液中的樹脂，2-PE總產(chǎn)量達32.5 g/L[12]，在發(fā)酵液中加入樹脂進行ISPR生物轉化，雖然取得了較高的產(chǎn)量，但樹脂需要滅菌和經(jīng)常更換，菌體與樹脂難分離，且發(fā)酵液易污染雜菌，難以實現(xiàn)真正的連續(xù)轉化培養(yǎng)。本研究采用酵母靜息細胞作為酶的載體，進行靜息細胞生物轉化-微濾膜分離菌體-大孔吸附樹脂吸附產(chǎn)物的ISPR技術合成轉化2-PE，可有效解決生長細胞轉化液組分復雜副產(chǎn)物多、易污染、樹脂難分離、操作復雜、以及有機廢水排放量大等問題，大幅提高2-PE的產(chǎn)量[13]。產(chǎn)物吸附在樹脂柱中，樹脂無需分離和滅菌，ISPR運行不需要在無菌條件下進行，細胞可多批次重復使用，可進行連續(xù)轉化合成2-PE，具有潛在的應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

菌種SaccharomycescerevisiaeH003由本實驗室篩選獲得，現(xiàn)保存于江西省科學院微生物研究所。

1.1.1 主要試劑

L-苯丙氨酸購自河北冀海生物科技有限公司，純度99.5%；2-PE標準品(Sigma公司)；甲醇為色譜純，其他試劑均為國產(chǎn)分析純,HZ-816大孔樹脂(上海華震科技有限公司)。

1.1.2 主要設備

2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；HC-C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，美國Agilent公司；7890B氣相色譜儀(FID檢測器)，美國Agilent公司，DB-WAX毛細管柱(30 m×0.53 mm×1.0 μm)，美國Agilent公司； H2500R-2高速冷凍離心機，湖南湘儀；5 L發(fā)酵罐，上海保興生物技術公司；平板式微濾裝置，Pellicon2 Mini Cassette微濾膜(孔徑0.45 μm),美國KOCH公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)基(麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基值g/L)：葡萄糖 30，蛋白胨 5，酵母粉 3，麥芽汁 3，pH自然；

細胞增殖培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 30，蛋白胨 5，酵母粉 3，麥芽汁 3，pH值為5.8～6.2；

從斜面挑取1～2環(huán)菌苔至30 mL種子液中，于28 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h，接種至150 mL種子液中于相同條件進行擴大培養(yǎng)20 h后，接入裝有3 L種子液的發(fā)酵罐中進行增殖培養(yǎng)20 h,培養(yǎng)條件28 ℃、轉速300 r/min、通氣量0.25 vvm。

1.2.2 靜息細胞制備

細胞培養(yǎng)液于8 000 r/min離心5 min，收集細胞，用0.1 mol/L(pH 5.1)的K3PO4緩沖液洗滌細胞2次，將菌體重懸于緩沖液中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 5 L罐靜息細胞轉化條件

用0.1 mol/L(pH 5.1)的K3PO4緩沖液配制不同濃度的靜息細胞液，加入底物L-苯丙氨酸(L-Phe)和輔助底物乙醇，于28 ℃、200～400 r/min、通氣量0.2～0.5 vvm進行轉化24 h。

1.2.4 5 L生物反應器-微濾膜系統(tǒng)-樹脂柱產(chǎn)物吸附串聯(lián)ISPR連續(xù)轉化試驗

取一定量的樹脂預處理后用 0.1 mol/L(pH 5.1)的K3PO4緩沖液分裝兩根樹脂柱，連接5 L生物反應器-超濾膜系統(tǒng)-樹脂柱吸附裝置。將2.5～3.0 L 0.8 g/L靜息細胞液置于5 L生物反應器中，加入L-Phe10 g/L和乙醇16 g/L，于優(yōu)化的條件下進行轉化。當轉化液中產(chǎn)物濃度高于2.8 g/L時，啟動超濾膜系統(tǒng)和樹脂柱裝置進行產(chǎn)物原位分離，超濾膜濃液返回反應器中，清液進入樹脂柱進行產(chǎn)物吸附，通過樹脂柱的清液再經(jīng)在線過濾器后泵回反應器中，當反應器中轉化液的2-PE濃度低于0.5 g/L結束料液循環(huán)。當轉化液中產(chǎn)物濃度再次高于2.8 g/L時，再進行新的循環(huán)吸附。如此連續(xù)轉化至轉化速率低于0.15 g/(L·h)時，終止轉化。細胞離心分離或微濾膜分離后懸浮于緩沖液中，用于下一批次的轉化。由于靜息細胞在轉化過程中仍有少量的出芽生殖，需對細胞濃度進行監(jiān)控，當細胞濃度高于1.1 g/L時，適量分流一部分細胞至罐外或移至另一反應器中，同時補入適量的緩沖液和底物進行轉化，如此2個反應罐切換操作，實現(xiàn)連續(xù)轉化吸附的生產(chǎn)過程。

1.2.5 靜息細胞重復利用活性比較

每次轉化結束后，將靜息細胞離心或用微濾膜過濾收集菌體細胞，重新懸浮于緩沖液中，置4 ℃冰箱保存。待下一批次轉化時使用。采用多次使用的細胞與新制備的細胞在相同轉化條件下進行ISPR的試驗，測定轉化速率的變化和催化穩(wěn)定性。

1.2.6 產(chǎn)物的洗脫和收集

吸附在樹脂柱中的2-PE用1.5～2.5倍樹脂柱體積的乙醇洗脫，洗脫流速為3.0～4.5 m3/[m3(柱容)·h]，得至約2.0倍樹脂體積的2-PE粗品。

1.2.7 反相高效液相色譜法測定L-PHE含量

樣品經(jīng)10 000 r/min離心5 min，取上清液，稀釋，于HPLC分析。流動相為V(甲醇)∶V(水)=50%∶50%，流速為1.0 mL/min，檢測波長260 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

1.2.8 氣相色譜法測定2-PE和乙醇含量條件[14]

樣品經(jīng)10 000 r/min離心5 min，取上清液，稀釋，用0.22 μm聚醚有機濾膜過濾。分析條件：載氣(N2)、氫氣、空氣流速分別為5、30、300 mL/min；進樣器和檢測器溫度均為250 ℃，升溫程序：80 ℃(2 min) →升溫速率(20 ℃/min)→220 ℃(3 min)；進樣方式：分流進樣，分流比：10∶1；檢測器：FID；進樣量：1 μL。

2 結果和分析

2.1 細胞濃度對轉化合成2-PE的影響

利用酵母細胞靜息細胞轉化合成2-PE，細胞作為艾氏途徑催化反應酶的載體，細胞濃度直接影響參與反應的酶量，進而影響其催化轉化的反應速率和轉化率。用0.1 mol/L(pH 5.1)的K3PO4緩沖液配制不同的細胞濃度，加入L-Phe 8 g/L、乙醇16 g/L，于28 ℃、200 r/min，0.3 vvm條件下轉化24 h，結果見圖1。

圖1 細胞濃度對轉化合成2-PE合成的影響Fig.1 Effect of cell concentration on 2-PE production bybioconversion

結果表明，細胞濃度低于0.8 g/L時，2-PE產(chǎn)量較低，當初始細胞濃度為1.0 g/L時，2-PE產(chǎn)量達到最高，繼續(xù)提高細胞濃度不能增加2-PE的產(chǎn)量，這可能是由于過多的菌體導致溶氧供應不足，同時影響溶液的傳質效率，不利于轉化進行，因此細胞量控制在0.8～1.1 g/L比較合適。

2.2 攪拌速率和通氣量對轉化合成2-PE的影響

在靜息細胞的轉化過程中需要一定的氧的參與，攪拌速率對底物與產(chǎn)物的傳質有一定的影響，分別考察了在不同的通氣量和攪拌速率下對產(chǎn)物生成的影響。圖2為靜息細胞濃度為1.0 g/L，L-Phe8 g/L，乙醇16.5 g/L，于28℃、300 r/min、不同通氣量條件下轉化24 h的2-PE產(chǎn)量。圖3為在相同條件下，靜通氣量為0.3 vvm，不同攪拌速率轉化合成2-PE產(chǎn)量。

圖2 通氣量對2-PE產(chǎn)量的影響Fig.2 The effect of ventilate volume on 2-PE bioconversion

當通氣量達0.2 vvm，2-PE產(chǎn)量明顯提高，通氣量達到0.3 vvm時，2-PE產(chǎn)量達到最高，繼續(xù)提高通氣量，產(chǎn)量沒有提高。當攪拌速率為300 r/min時產(chǎn)量明顯增加，繼續(xù)增加攪拌速率，產(chǎn)量變化不大，優(yōu)化的通氣量和攪拌速率為0.3 vvm和300 r/min。

圖3 攪拌速率對2-PE產(chǎn)量的影響Fig.3 The effect of stir speed on 2-PE bioconversion

2.3 單罐產(chǎn)物原位轉移轉化試驗

在5 L反應罐中加入0.8 g/L靜息細胞懸浮液3.0 L，加入底物和輔助底物，在優(yōu)化的轉化條件下進行轉化反應。用緩沖液裝填2支樹脂柱，每柱裝有大孔樹脂550 g，柱體積為744.5 mL。每20～24 h開啟ISPR裝置進行原位產(chǎn)物分離，定時取樣測定底物、輔助底物及產(chǎn)物濃度，根據(jù)濃度的變化適當補加底物和輔助底物，使底物和輔助底物濃度分別控制在3～10 g/L和5～16 g/L之間，同時監(jiān)控細胞濃度，當罐內細胞濃度高于 11 g/L時，將適當?shù)募毎瞥龉尥?，同時補入適當?shù)木彌_液以控制細胞濃度在7～11 g/L之間。轉化結束后離心收集細胞，置4 ℃冰箱保存。用約1.5倍樹脂柱體積的純水置換樹脂柱中的轉化液，再用約1.5～2.0倍樹脂柱體積的乙醇洗脫產(chǎn)物。表1為分別連續(xù)運行不同時間的底物添加量、產(chǎn)量、摩爾轉化率和平均轉化速率。

表1 靜息細胞單罐運行ISPR轉化合成2-PE試驗結果Table 1 The result of ISPR continuous bioconversion of 2-PE by resting cell in single bioreactor

隨著轉化時間的延長，2-PE產(chǎn)量亦顯著增加，連續(xù)運行145 h后，2-PE總產(chǎn)量達72.18 g，折算產(chǎn)量達24.06 g/L，摩爾轉化率為79.34%。平均轉化速率隨著轉化時間的延長略有下降，這可能是因為隨著轉化時間的延長，罐內細胞濃度增加，在66 h后細胞濃度可達到11 g/L以上，在ISPR運行過程中，需將細胞濃液分流一部分體積的細胞至罐外，再另補加相同體積的緩沖液以維持罐內較適的細胞濃度，轉化時間越長， 移出罐外的細胞越多，而移出罐外的細胞液中含有較高濃度的L-Phe，這對摩爾轉化率和平均轉化速率會有一定的影響，為提高ISPR的運行穩(wěn)定性和細胞的利用率，可以采用雙罐同時運行的方式進行連續(xù)ISPR運行。

2.4 雙罐產(chǎn)物原位轉移轉化試驗

在單罐運行ISPR裝置中增加1個轉化罐， ISPR運行68 h將約1 L左右靜息細胞濃液轉移至第2罐中，在2個罐中分別補入適量的緩沖液和底物等在相同的條件下進行轉化反應用，之后每20～24 h轉入少量的細胞至第2罐中，至體積達到3 L左右結束轉化，結果見表2。

表2 靜息細胞雙罐運行ISPR轉化合成2-PE試驗結果Table 2 The result of ISPR continus bioconversion of 2-PE by resting cell in double bioreactors

雙罐ISPR分別運行了121.3 h和144.7 h，在相同時間內產(chǎn)量比單罐有顯著提高，產(chǎn)量分別增加12.75%和24.10%，隨著轉化時間增加，產(chǎn)量有可能得到更大幅度的提高。摩爾轉化率和平均轉化速率也明顯提高，摩爾轉化率均達80%以上，平均轉化速率達0.2 g/(L·h)。

2.5 靜息細胞重復利用活性比較

取上述試驗置冰箱保存的重復使用10批次的靜息細胞液(濃度8 g/L)2.5 L,新制備靜息細胞液(濃度8 g/L)2.5 L分別加入5 L罐中進行ISPR轉化試驗，在相同的條件下進行單罐轉化96 h，運行期間細胞未移出罐外，運行52 h和80 h后，在2罐中分別加入緩沖液約400 mL和300 mL，表3為2罐的細胞轉化合成2-PE的產(chǎn)量和轉化速率。

表3 不同使用批次的靜息細胞連續(xù)轉化2-PE結果Table 3 The result of ISPR bioconversion of 2-PE by different batch resting cell

注：*試驗罐1為新制靜息細胞液，試驗罐2為重復使用10批次的靜息細胞液。

重復利用10次的靜息細胞液與新制備的靜息細胞液在單罐中連續(xù)運行96 h，最終2-PE產(chǎn)量分別達16.67 g/L和16.53 g/g，平均轉化速率亦未明顯下降，這表明靜息細胞在進行重復利用，生物活性沒有明顯下降，在實際生產(chǎn)中可大大降低細胞培養(yǎng)和靜息細胞制備的次數(shù)。

3 小結

通過在5 L發(fā)酵罐中轉化條件的優(yōu)化，確定了酵母靜息細胞優(yōu)化的轉化條件為：細胞濃度8～11 g/L,通氣量0.3 vvm，攪拌速率300 r/min 。在優(yōu)化的條件下進行ISPR連續(xù)生物轉化2-PE，單罐分別連續(xù)運行72、96、120、145 h,隨著轉化時間的增加，2-PE產(chǎn)量逐漸增加，最高罐產(chǎn)量達24 g/L，摩爾轉化率均在80%左右，平均轉化速率在0.165～0.18 g/(L·h)之間。雙罐運行144 h，2-PE在產(chǎn)量達29.86 g/L,摩爾轉化率和平均轉化速率上比單罐運行均有所提高，靜息細胞重復使用10批次，產(chǎn)量和平均轉化速率沒有明顯下降。

由于靜息細胞生物轉化的優(yōu)勢，目前在天然化合物的生物合成、藥物前體化合物轉化等領域已展開了靜息細胞生物轉化合成的研究[15-16]，而生物轉化合成2-PE還主要集中在采用生長細胞培養(yǎng)轉化[10-12]。生長細胞在發(fā)酵液中加入樹脂進行ISPR生物轉化合成2-PE，雖然可獲得較高的產(chǎn)量，但樹脂需要滅菌，反復的高溫滅菌會影響樹脂的吸附效率，樹脂難以回收；且培養(yǎng)液中含大量糖、酵母粉等有機物，易污染雜菌，有機廢水排放量大，導致生長細胞在實際生產(chǎn)過程中進行ISPR技術難以實現(xiàn)。采用酵母靜息細胞轉化合成2-PE的優(yōu)勢在于轉化液組分非常簡單(只含底物、乙醇和少量無機鹽)、副產(chǎn)物少、產(chǎn)品易于分離純化；細胞可以重復利用，不用頻繁培養(yǎng)和制備細胞，大大減少了發(fā)酵有機廢水排放，是一種清潔的生產(chǎn)工藝。尤其是靜息細胞可長時間保持生物活性，無需在無菌條件下運行，操作簡單，這是實現(xiàn)ISPR連續(xù)運行的關鍵，在未來工業(yè)上的應用具有明顯的優(yōu)勢。