蔣敏，王苗，李恒，史勁松

(江南大學 藥學院，江蘇 無錫，214122)

功能性低聚糖是一種只能被結(jié)腸微生物發(fā)酵利用的重要功能因子。大量現(xiàn)代科學研究證明其可以通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)預防、干預甚至治療慢性代謝性疾病。隨著對低聚糖研究的逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)相同低聚糖對不同人群作用效果不同，這是由于不同人群的腸道微生物具有多樣性和特異性，而不同腸道微生物對相同低聚糖利用的速率和程度各不相同，代謝產(chǎn)物也存在較大差異[1-2]。因此探究低聚糖與腸道微生物之間的關(guān)系，對實現(xiàn)低聚糖的個性化治療具有重要意義。

魔芋低聚甘露糖(konjac mannon oligosaccharide， KMOS)是一種廣泛存在于植物(如魔芋粉、瓜兒豆膠、田菁膠)與微生物(如酵母)新型功能低聚糖。據(jù)報道，其具有多種生理功能，包括降脂[3]、調(diào)節(jié)人體多部位(如皮膚[4]、腸道[5]、生殖器[6]等)的微生態(tài)環(huán)境等。機理研究表明KMOS可通過以下幾條途徑調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)：(1)能夠選擇性地促進腸道內(nèi)有益菌的增殖，秦清娟等[7]通過小鼠盲腸內(nèi)容物體外厭氧發(fā)酵發(fā)現(xiàn)KMOS可被腸道菌有效利用，明顯增加腸道益生菌(雙歧桿菌、乳酸菌)的數(shù)量；王敏等[8]將KMOS摻入到飼料中飼喂大鼠30 d，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，KMOS飼喂組大鼠盲腸內(nèi)容物中雙歧桿菌和乳酸菌明顯增加。(2)能被代謝成有益的代謝產(chǎn)物，如揮發(fā)性脂肪酸等。(3)競爭性占據(jù)腸道上甘露糖受體，從而抑制有害菌在腸道內(nèi)的吸附等。

盡管KMOS對益生菌的選擇性增殖作用已被大量體外和體內(nèi)研究證實，但KMOS對腸道微生物的具體影響機制，如不同腸道微生物對KMOS的利用規(guī)律、代謝產(chǎn)物的種類和含量等目前尚不明確。為了進一步解析KMOS益生機制，本研究選擇了3株不同來源的、可降解利用KMOS的微生物(Bifidobacteriumadolescentis，Bacteroidesuniformis，Lactobacillusjohnsonii)，研究比較三者對KMOS的降解利用規(guī)律及代謝產(chǎn)物，為開發(fā)KMOS為主體的功能性食品提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)備與材料

DG 250厭氧培養(yǎng)工作站，Don Whitley Science公司；高溫滅菌鍋，致微廈門儀器有限公司；pH計，梅特勒-托利多(上海)有限公司； GC-2010型氣相色譜儀，日本Shimadzu公司；高效液相色譜儀(U 3000)，賽默飛(中國)有限公司；酶標儀，美國分子有限公司。

KMOS由成都永安制藥有限公司提供；乙酸、丙酸、丁酸(正丁酸、異丁酸)、戊酸(正戊酸、異戊酸)、己酸、乳酸、琥珀酸等標準品均購自上海源葉生物科技有限公司； G型薄層層析硅膠板購自青島海洋化工有限公司；Bifidobacteriumadolescentis，Bacteroidesuniformis，Lactobacillusjohnsonii為本實驗室分離篩選保藏的菌種。其他試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖8.0、 胰蛋白胨3.0、 酵母提取物4.5、 No.3膽鹽0.4、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.8、 氯化血紅素0.05、 NaCl 4.5、 KCl 2.5、 MgCl2·6H2O 0.45、 CaCl2·6H2O 0.2、 KH2PO40.4、 1 mL Tween 80、2 mL微量元素(MgSO4·7H2O 3.0、 MnCl2·4H2O 0.32、 FeSO4·7H2O 0.1、CoSO4·7 H2O 0.18、CaCl2·2H2O 0.1、 ZnSO4·7H2O 0.18、 CuSO4·5H2O 0.01、 NiCl2·6H2O 0.092)，pH值6.5，121 ℃濕熱滅菌20 min，待用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：上述種子培養(yǎng)基中以KMOS(0.22 μm過濾除菌)代替葡萄糖，其他成分均一致。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化及靜態(tài)培養(yǎng)

參考文獻方法[9]，取-80 ℃保菌管中保存的菌種，接種至種子培養(yǎng)基中，活化24 h后以0.1 g/L接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的50 mL除氧發(fā)酵培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)工作站(H2, CO2，N2的體積分數(shù)分別為10%，10%和80%)靜態(tài)厭氧發(fā)酵72 h。定期取樣，檢測OD值，4 ℃，12 000 r/min離心，除去菌體，獲得發(fā)酵上清，待測。每個樣品設(shè)定3個平行。

1.3.2 檢測

1.3.2.1 KMOS的降解情況

采用薄層層析色譜法(TLC)檢測KMOS在厭氧發(fā)酵過程中被降解利用的情況。展開劑為V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)=2∶2∶1，顯色劑為苯胺-二苯胺溶液磷酸溶液(精確稱取4 g二苯胺，與4 mL苯胺、20 mL 8.5 g/L磷酸溶液共溶解于200 mL丙酮，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存)。

取不同時間的發(fā)酵上清，在硅膠薄層板上點樣，上樣量為5 μL，點樣后放入預飽和層析缸中密閉靜置，層析結(jié)束后，將顯色劑均勻的噴灑在硅膠板上，105 ℃加熱10 min，顯色拍照。隨后立即采用Image J軟件對薄層色譜的組分斑點進行灰度積分，用于表征組分相對含量(%)。

1.3.2.2 有機酸的測定

取500 μL待測液，加入200 μL的ZnSO4溶液(300 g/L)與200 μL亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L)，充分混勻后，12 000 r/min離心10 min，除去蛋白及雜質(zhì)，取上清用0.22 μm的濾膜進行過濾，待測。

采用高效液相色譜儀檢測有機酸含量，色譜柱：Waters Atlantis T3，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動相：20 mmol/L NaH2PO4，pH 2.7(用磷酸調(diào))；流速：0.7 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：UV 210 nm。

1.3.2.3 短鏈脂肪酸(short chain fatty acid, SCFA)的測定

取8 mL待測液置于15 mL頂空瓶中，將老化后的75 μm Car/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分，50 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，同時啟動儀器(SCION SQ 456-GC)采集數(shù)據(jù)。

采用氣相色譜法檢測發(fā)酵液中SCFA種類以及含量，色譜柱： DB-WAX 30 mol/L (I.D.0.32 mm，5 μm)；升溫程序為50 ℃保持3 min，然后以6 ℃/min升溫速度升溫至120 ℃，并保持0.5 min， 再以6 ℃/min升溫速度至220 ℃，并保持5 min； 載氣為N2和H2，流速分別設(shè)定為3 mL/min與47 mL/min；空氣流量為400 mL/min；樣品進樣量為1.0 μL；分流比1∶3。

1.3.3 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0軟件進行，實驗結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物生長情況

微生物生長情況如圖1所示。分析可見，3種菌在培養(yǎng)基中均生長良好，但增殖趨勢差異較大。其中Bifidobacteriumadolescentis與BacteroidesuniformisU的生長曲線趨勢相近，均可分為2個階段，其中Bifidobacteriumadolescentis在0～36 h內(nèi)處于對數(shù)期，36 h時菌體數(shù)量達到最大值(OD600約為0.45)，隨后進入穩(wěn)定期，菌體數(shù)量保持穩(wěn)定；與Bifidobacteriumadolescentis相比，BacteroidesuniformisU增長速度較快，0～6 h時處于生長對數(shù)期，6 h時OD600值已達到0.4左右，隨后進入穩(wěn)定期，OD600值基本保持穩(wěn)定；與前兩者不同的是，Lactobacillusjohnsonii的生長曲線分為3個階段，即首先在0～6 h內(nèi)快速增長，6～60 h內(nèi)仍保持生長，但增長速度明顯下降，在60～72 h時增殖速度又有所提高。由此可推測，3株菌對KMOS的利用存在明顯的差異。

圖1 不同菌株生長曲線(n=3)Fig.1 The growth curves of different bacteria in vitrofermentation (n=3)

2.2 不同菌株對KMOS組分利用情況

為了進一步了解這3株菌對KMOS組分利用的特性，采用TLC定性檢測KMOS組分變化，并結(jié)合TLC斑點灰度積分對組分的相對含量進行半定量檢測。結(jié)果如圖2、圖3和圖4所示。綜合可見，不同菌株對KMOS的利用存在異同點，其主要體現(xiàn)在三者均主要利用KMOS低分子組分，但對組分的利用規(guī)律存在明顯差異。

由圖2-A可見，Bifidobacteriumadolescentis能夠利用DP 2、3、4的組分，但三者的利用速率和程度存在明顯不同。相對含量分析圖2-B顯示，在發(fā)酵初期，Bifidobacteriumadolescentis優(yōu)先快速利用DP 2組分，在24 h時，DP 2組分基本已經(jīng)被消耗完全，而DP 3、4組分在此時才逐步開始被利用，且利用速率和利用程度明顯低于DP 2組分，數(shù)據(jù)表明在72 h時DP 3組分被消耗80%，而DP 4組分僅被消耗50%。

由圖3-A可見，72 h內(nèi)，擬桿菌主要利用聚合度DP≤3的低分子組分，而DP>3的組分幾乎不能被利用。圖3-B數(shù)據(jù)表明，DP 2、3組分均在發(fā)酵初期就開始被BacteroidesuniformisU使用，其中DP 2組分在9 h內(nèi)被利用完全，而DP 3組分則需要36 h才能消耗完全，說明BacteroidesuniformisU對DP 2組分的利用效率要明顯大于DP 3組分。

由圖4-A可見，Lactobacillusjohnsonii主要利用DP 2、3組分，從相對含量分析數(shù)據(jù)(圖4-B)可見，Lactobacillusjohnsonii對組分的使用存在明顯的遲滯性，其在36 h時才開始利用DP 2組分，在48 h時開始利用DP 3組分，但2個組分均在72 h時幾乎被消耗結(jié)束。

2.3 有機酸的檢測結(jié)果

大量文獻表明，功能低聚糖在腸道內(nèi)被微生物降解利用后可產(chǎn)生大量有機酸，其在腸道內(nèi)既可以降低消化道pH值，改善生理環(huán)境，又可以發(fā)揮有效的抑菌殺菌效果，改善生態(tài)環(huán)境。3株菌產(chǎn)有機酸結(jié)果如圖5所示。由圖可知，隨著發(fā)酵的進行，三者產(chǎn)物中乳酸持續(xù)積累，在發(fā)酵末期,乳酸積累量幾乎一致，但是發(fā)酵產(chǎn)乳酸的規(guī)律明顯不同。其中BacteroidesuniformisU產(chǎn)乳酸的速率明顯高于其他兩者，這與菌體生長曲線及KMOS利用規(guī)律相一致，說明BacteroidesuniformisU能在迅速利用KMOS用于生長并產(chǎn)生乳酸。由圖可見，其乳酸積累曲線可分為兩個階段，即在0～24 h內(nèi)乳酸產(chǎn)量快速增加，24 h時積累量達到4 mmol/L，隨后乳酸積累量仍不斷增長，但是增長速率顯著減緩，72 h時達到最大積累量(5.03 mmol/L)；而Bifidobacteriumadolescentis與Lactobacillusjohnsonii乳酸積累曲線趨勢一致，兩者均呈緩慢持續(xù)性增長，直至72 h時達到乳酸最大積累量(分別為5.06 mmol/L與4.79 mmol/L)，結(jié)合生長曲線與KMOS利用情況，推測這可能是由于兩者對KMOS組分的利用存在一定遲滯性造成。

A-TLC； B-相對含量圖2 TLC分析Bifidobacterium adolescentis在厭氧發(fā)酵過程中對KMOS的降解Fig.2 TLC analyze the degradation of KMOS by Bifidobac-terium adolescentis in vitro fermentation

A-TLC； B-相對含量圖3 TLC分析Bacteroides uniformis U在厭氧發(fā)酵過程中對KMOS的降解Fig.3 TLC analyze the degradation of KMOS by Bact-eroides uniformis in vitro fermentation

A-TLC； B-相對含量圖4 TLC分析Lactobacillus johnsonii在厭氧發(fā)酵過程中對KMOS的降解Fig.4 TLC analyze the degradation of KMOS by Lacto-bacillus johnsonii in vitro fermentation

A-乳酸; B-琥珀酸圖5 不同菌產(chǎn)有機酸情況分析(n=3)Fig.5 The production of organic acids in vitro fermentation(n=3)

對琥珀酸積累過程(圖5-B)分析發(fā)現(xiàn)，三者均存在琥珀酸二次積累現(xiàn)象，但積累速率和積累量有明顯差異。由圖可見，0～12 h內(nèi)三者快速積累琥珀酸，隨后基本保持穩(wěn)定，在36～72 h時琥珀酸又出現(xiàn)二次積累。比較發(fā)現(xiàn)，Lactobacillusjohnsonii兩次產(chǎn)琥珀酸的速率明顯高于其他兩者，且在72 h時Lactobacillusjohnsonii琥珀酸積累量最高，達到5.38 mmol/L，分別是Bifidobacteriumadolescentis與BacteroidesuniformisU的3.6和5.5倍，說明Lactobacillusjohnsonii具有較強的產(chǎn)琥珀酸能力。此外，結(jié)合菌體生長曲線以及KMOS利用規(guī)律，推測Lactobacillusjohnsonii在發(fā)酵后期快速產(chǎn)生琥珀酸的原因是由于在48～72 h時，隨著KMOS被Bifidobacteriumadolescentis與BacteroidesuniformisU的大量消耗，菌體生長已處于穩(wěn)定期，而此時Lactobacillusjohnsonii不僅仍處于生長活躍期，且KMOS組分在此階段才開始逐漸被利用。

2.4 SCFA檢測結(jié)果

SCFA又稱易揮發(fā)性酸，是腸道微生物發(fā)酵碳水化合物的主要代謝產(chǎn)物，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸等，具有重要的生理活性，其可以降低結(jié)腸的pH值，控制有害酶的作用，抑制非耐酸的細菌，沉淀膽鹽，降低血清膽固醇等，同時也可以抑制革蘭陰性菌的生長，促進雙歧桿菌和乳酸菌等有益菌的生長[10]。本實驗采用氣相色譜法(GC)檢測不同腸道菌利用KMOS生長72 h產(chǎn)SCFA情況，結(jié)果如表1所示。數(shù)據(jù)表明，3株菌發(fā)酵均能產(chǎn)生乙酸、丁酸、戊酸、己酸，而未檢測到丙酸，這與之前報道[1,11]不相一致，這可能是由于體外單菌發(fā)酵與菌群發(fā)酵差異所造成，也有可能是丙酸以乳酸(2-羥基丙酸)的形式存在[2]。乙酸均是3株菌主要SCFA產(chǎn)物，約占各自SCFA總量的90%～95%。比較可見，BacteroidesuniformisU乙酸產(chǎn)量最高，72 h達到(98.6±0.7)×10-5g/mL，Bifidobacteriumadolescentis乙酸產(chǎn)量次之，為(72.1±0.9)×10-5g/mL，Lactobacillusjohnsonii最低，為(55.0±0.9)×10-5g/mL。

對腸道菌產(chǎn)丁酸數(shù)據(jù)分析可知，72 h時，Bifidobacteriumadolescentis丁酸產(chǎn)量最高，最大值為(14.0±0.1)×10-5g/mL，其次是BacteroidesuniformisU，72 h達到(8.7±0.2)×10-5g/mL，Lactobacillusjohnsonii最低，產(chǎn)量為(4.8±0.1)×10-5g/mL。

Bifidobacteriumadolescentis戊酸產(chǎn)量最高，達到(5.4±0.7)×10-5g/mL，BacteroidesuniformisU與Lactobacillusjohnsonii戊酸產(chǎn)量相近，分別為(2.8±0.1)×10-5g/mL和(2.6±0.2)×10-5g/mL。

Bifidobacteriumadolescentis產(chǎn)己酸最高，72 h時達到(6.2±0.2) mg/100 mL，BacteroidesuniformisU次之，產(chǎn)量為(5.5±0.3)×10-5g/mL，Lactobacillusjohnsonii最低，為(3.1±0.2)×10-5g/mL。

表1 不同微生物發(fā)酵過程中短鏈脂肪酸產(chǎn)生情況(n=3)Table 1 The production of SCFAs in vitro anaerobicfermentation by (n=3)

3 結(jié)論

本研究以KMOS為唯一碳源篩選獲得的3株不同屬源(雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、乳酸菌屬)的,可降解KMOS的微生物(Bifidobacteriumadolescentis、BacteroidesuniformisU、Lactobacillusjohnsonii)為研究對象，通過體外靜態(tài)培養(yǎng)的方式探討了三者對KMOS的利用規(guī)律以及產(chǎn)酸情況。研究結(jié)果表明，Bifidobacteriumadolescentis能利用DP≤4組分，但只有DP 2組分能在24 h內(nèi)被完全消耗，其他組分(DP 3～4)利用不完全且有遲滯性；BacteroidesuniformisU在初期就快速利用DP 2～3組分，且分別在6、36 h內(nèi)消耗完全；Lactobacillusjohnsonii在三者中遲滯效應最顯著，直至36、48 h時才開始分別利用DP 2～3組分，但是在72 h時兩個組分均被其完全消耗，這說明微生物對KMOS的利用存在選擇性和時效性，這與前期報導相一致[1-2]。可以認為，正是由于KMOS微生物代謝利用的特異性，導致了菌株間生長曲線和代謝產(chǎn)酸的差異，而不同的酸性產(chǎn)物在人體參與不同器官的代謝，發(fā)揮多種功效，如乙酸大部分能被血液吸收，主要參與肌肉、脾臟、心臟和腦的代謝，能為機體提供能量，同時也是膽固醇合成的主要底物；丙酸經(jīng)肝代謝后為機體提供能量，并且能抑制膽固醇的合成，具有一定的輔助調(diào)節(jié)血脂的作用；丁酸在SCFA中所占比例較小但其尤為重要，它能夠被結(jié)腸上皮細胞吸收利用，為結(jié)腸和盲腸提供能量，還能抑制腫瘤細胞的增殖分化、調(diào)節(jié)基因表達，對結(jié)腸炎和結(jié)腸癌起到預防作用[12-14]，由此推測，通過改變低聚糖組成成分及相應含量有可能實現(xiàn)腸道菌群結(jié)構(gòu)地定向調(diào)節(jié)，此外可以通過合理選擇益生菌與益生元組合，可實現(xiàn)腸道代謝產(chǎn)物種類及含量可控化，從而實現(xiàn)合生元的精準化治療，但由于本研究采用的靜態(tài)培養(yǎng)僅能反應單一菌的代謝情況，與實際腸道菌群還有很大差距，因此還有待進一步研究與探索。

KMOS作為一種極具開發(fā)應用前景的益生元，在調(diào)節(jié)腸道菌群方面的作用具有很重要的研究意義。本研究揭示了3株菌對KMOS的降解利用規(guī)律及代謝產(chǎn)物產(chǎn)生情況，為KMOS益生元的開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)，同時也為其開發(fā)合生元組合提供相應的實驗依據(jù)。