周鵬

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院；安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所；中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

李雯婧,陳筱彤,汪劍虹

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230012 )

丁婉雪

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院；安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽 合肥 230012)

黃金玲

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院；安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所；中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

苓桂術(shù)甘湯(Ling-Gui-Zhu-Gan Decoction，LGZGD)出自漢代張仲景《傷寒雜病論》，是益氣溫陽(yáng)、健脾化飲的經(jīng)典名方，臨床廣泛應(yīng)用于心血管疾病防治，包括不穩(wěn)定型心絞痛、心律失常、心肌炎、慢性心力衰竭、心腎綜合征等，療效確切[1～3]。課題組前期開展的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，苓桂術(shù)甘湯抑制急性心梗后心室重構(gòu)的作用機(jī)制與抑制IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活有關(guān)[4,5]，但其發(fā)揮NF-κB抑制活性的化學(xué)成分目前尚不清楚，因此，通過(guò)虛擬篩選苓桂術(shù)甘湯中的NF-κB抑制劑，對(duì)明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和開發(fā)新藥均具有十分重要意義。

中藥復(fù)方發(fā)揮臨床療效關(guān)鍵在于中藥中的有效化學(xué)成分與相應(yīng)靶點(diǎn)結(jié)合后發(fā)揮藥理作用，其本質(zhì)是藥物分子與受體的氨基酸殘基結(jié)合形成藥物-受體復(fù)合物，主要有靜電作用、離子鍵、分子間氫鍵和范德華力等。分子對(duì)接技術(shù)作為一種重要的計(jì)算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計(jì)手段，主要用于研究蛋白質(zhì)受體和藥物小分子之間通過(guò)幾何匹配和能量匹配從而相互識(shí)別實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)輔助藥物篩選的過(guò)程[6]。Molecular Operating Environment (MOE)是常用的分子對(duì)接軟件，當(dāng)靶標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)已知，分子對(duì)接技術(shù)結(jié)合虛擬篩選可完成目標(biāo)先導(dǎo)化合物的活性篩選[7,8]。因此，本研究采用分子對(duì)接軟件MOE，以苓桂術(shù)甘湯中文獻(xiàn)報(bào)道的小分子化合物作為配體，與NF-κB靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，根據(jù)兩者結(jié)合能力打分結(jié)果，分析苓桂術(shù)甘湯中潛在的抑制NF-κB的活性成分，為進(jìn)一步開發(fā)苓桂術(shù)甘湯和發(fā)現(xiàn)新型NF-κB抑制劑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 靶標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的獲取和預(yù)處理

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www.rcsb.org)下載NF-κB的三維晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 1MY5)[9]。采用分子對(duì)接軟件MOE(2008.10)對(duì)原始結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理，為蛋白質(zhì)加氫，加電荷操作，刪除水分子操作，能量?jī)?yōu)化后，運(yùn)用Site Finder尋找出氨基酸殘基結(jié)合位點(diǎn)的疏水性口袋，即保留靶點(diǎn)的可能活性區(qū)域。

1.2 小分子配體構(gòu)建

從傳統(tǒng)中藥數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找苓桂術(shù)甘湯中4味中藥茯苓、桂枝、白術(shù)和甘草相關(guān)活性化合物，根據(jù)成藥性原則，選取同時(shí)滿足口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug-Likeness，DL)≥0.18、相對(duì)分子量M<500、半衰期(Half Life，HF)≥4h的71個(gè)化學(xué)成分作為候選成分[10](見表1)。從PubChem 化合物數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下載71個(gè)小分子化學(xué)成分的3D結(jié)構(gòu)，并通過(guò)ChemDraw軟件轉(zhuǎn)化成mol格式后，在MOE軟件中對(duì)每個(gè)分子進(jìn)行加氫處理及Minimize能量?jī)?yōu)化后，采用Flexible Alignment將其轉(zhuǎn)化成柔性分子，用于對(duì)接。

表1 苓桂術(shù)甘湯中小分子化合物的化學(xué)信息

續(xù)表1

1.3 分子對(duì)接

用MOE-Dock模塊，將配體與受體進(jìn)行半柔性對(duì)接，放置函數(shù)選用Triangle Matcher、打分函數(shù)選用London dG，其余采用默認(rèn)參數(shù)[11]，分別得到每個(gè)化合物與NF-κB的對(duì)接得分值，得分值越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定，將通過(guò)得分值的高低和與氨基酸殘基結(jié)合的數(shù)目評(píng)價(jià)化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合活性。

2 結(jié)果

以NF-κB為靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果采用MOE軟件對(duì)候選藥物與NF-κB活性位點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果體現(xiàn)在最低對(duì)接結(jié)合能上，結(jié)合能越低說(shuō)明配體與受體間的作用越強(qiáng)，即形成的復(fù)合物越穩(wěn)定。排在前10%的化合物均是黃酮類化合物，且打分高低排序是槲皮素>柚皮素>異槲皮酚>甘草列酮>山奈酚>異鼠李素>甘草黃酮醇A，其中槲皮素與NF-κB活性位點(diǎn)的匹配度最高，說(shuō)明槲皮素可作為天然的NF-κB抑制劑(表2)。通過(guò)分子對(duì)接結(jié)果的2D圖(圖1)，可以直觀看出活性化合物與NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，主要有分子間氫鍵和π-π共軛，主要的氨基酸殘基是Lys 218和Arg 274，說(shuō)明這兩個(gè)位點(diǎn)是主要結(jié)合位點(diǎn)。

表2 苓桂術(shù)甘湯較高活性化學(xué)成分與NF-κB靶點(diǎn)的對(duì)接情況

圖1 苓桂術(shù)甘湯較高活性化學(xué)成分與NF-κB靶點(diǎn)氨基酸殘基對(duì)接情況

3 結(jié)語(yǔ)

分子對(duì)接篩選中藥復(fù)方中活性成分的研究并不多見，本研究以苓桂術(shù)甘湯為對(duì)象，采用分子對(duì)接技術(shù)虛擬篩選方中71個(gè)化合物抑制NF-κB活性的有效物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物槲皮素、柚皮素、異槲皮酚、甘草列酮、山奈酚、異鼠李素、甘草黃酮醇A均具有較高的抑制NF-κB活性，以槲皮素作用最優(yōu)。本研究拓展了分子對(duì)接技術(shù)在中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制方面的應(yīng)用，并從分子水平闡述了苓桂術(shù)甘湯防治慢性心力衰竭作用的機(jī)制，為深入開發(fā)苓桂術(shù)甘湯和發(fā)現(xiàn)新型NF-κB抑制劑提供一定的理論依據(jù)。