湯峰林 丁 濤 朱浩明 張亞峰 張 欽 陸 淼 楊惠林

(南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院骨科，江蘇 南京 214000)

骨肉瘤是一種常見的惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、惡性程度高、發(fā)展速度快、預后差等特點〔1〕。據統(tǒng)計，骨肉瘤患者截肢后5年內的生存率僅有20%〔2〕。治療骨肉瘤的方法以手術為主，放化療輔助治療〔3〕。隨著小分子標志物在癌癥治療中的應用，尋找治療骨肉瘤的有效小分子標志物是目前研究的熱點。MicroRNAs(miRNAs)是一種廣泛存在于真核生物體內的小分子RNA，由20～25個核苷酸組成〔4〕。miRNA與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有密切關系。miRNA-375在宮頸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤中異常表達，且能夠影響癌細胞的生長〔5～7〕。本研究收集了骨肉瘤組織及對應的瘤旁組織，RT-PCR檢測組織中miRNA-375的表達，并通過細胞轉染的方法探討miRNA-375對骨肉瘤細胞增殖凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1組織及細胞 選取2011年7月至2014年12月在南京醫(yī)科大學附屬無錫市人民醫(yī)院骨科、無錫市中醫(yī)醫(yī)院骨科和蘇州大學附屬第一醫(yī)院骨科三家醫(yī)院確診切除的骨肉瘤患者的骨肉瘤組織及對應的瘤旁組織各50例，男28例，女22例，年齡50～60歲。所有患者在術前未接受放化療，組織標本采集經過患者及家屬同意。人骨肉瘤細胞MG-63購自于中科院細胞庫。

1.2主要儀器及試劑 680型酶標儀購自美國Bio-rad公司；Attune NxT流式細胞儀購自美國Thermo；胎牛血清購自美國Gibco；噻唑藍(MTT)、青鏈霉素、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自美國Sigma；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3單克隆抗體、酶切Caspase-9單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體均購自美國Abcam公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.3RT-PCR檢測組織中miR-375表達 取骨肉瘤組織放置研缽中，在液氮中研磨成粉狀，加入1 ml Trizol裂解液，充分研磨后放在室溫下裂解10 min。在裂解液中加入氯仿，每1 ml Trizol中加入200 μl氯仿，劇烈震蕩20 s，12 000 r/min，4℃離心15 min，移液槍吸取水相層至新的EP管中，加入等體積異丙醇混合均勻，在室溫下靜置20 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，棄上清。加入冰預冷的75%乙醇重懸RNA沉淀，10 000 r/min，4℃離心5 min，吸除上清液，放置于超凈工作臺中干燥后，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)，放在-80℃保存。紫外分光光度計檢測提取的RNA濃度及純度。反轉錄試劑盒說明書合成miR-375的cDNA。實時定量PCR試劑盒分析miR-375水平。以GAPDH為內參，采用2-△△CT測定值分析組織中miR-375表達水平。GAPDH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′;miR-375上游引物：5′-AGCCGTTTGTTCGTTCGGCT-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.4細胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細胞MG-63用含有10%胎牛血清、1×106U/ml青霉素、1×105U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃，飽和濕度，5% CO2培養(yǎng)箱。觀察細胞融合度達到90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代細胞，按照1∶3比例接種至細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.5細胞轉染 取培養(yǎng)至對數生長期的骨肉瘤細胞MG-63，胰蛋白酶消化后，用細胞培養(yǎng)液懸浮細胞，以5×103個細胞/孔接種到6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，觀察融合度達到60%時，吸除細胞培養(yǎng)液，用不含胎牛血清的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h。按照Lipofectamine2000轉染試劑說明書將miR-375 模擬物(miR-375 mimics組)和mimics control(陰性對照組)轉染至MG-63中，培養(yǎng)6 h后，更換為含胎牛血清的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。同時設立空白對照組，只加入轉染試劑。轉染后48 h，RT-PCR 檢測轉染后細胞中miR-375表達水平，步驟參照1.3。

1.6MTT檢測細胞增殖 骨肉瘤細胞MG-63轉染后，調整細胞濃度為3×105個/ml，以每孔100 μl細胞懸浮液接種至96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h后，加入50 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，放在37℃環(huán)境中孵育反應4 h，倒掉上清液，加入二甲基亞砜溶液150 μl充分混合后，輕度震蕩反應10 min，觀察結晶物完全溶解后，酶標儀檢測490 nm的吸光度(OD值)，同時設置調零組，調零組中不加入細胞，每組設置8個復孔，取平均值。計算細胞存活率。細胞存活率=(轉染組OD值-調零組OD值)÷(空白對照組OD值-調零組OD值)。

1.7堿性磷酸酶酶標儀讀數法檢測堿性磷酸酶活性 取轉染48 h后的骨肉瘤細胞MG-63，胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，按照堿性磷酸酶活性檢測試劑盒檢測細胞中堿性磷酸酶活性。

1.8流式細胞術檢測細胞凋亡 取轉染48 h后的骨肉瘤細胞MG-63，加入胰蛋白酶消化細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸洗滌細胞2次，收集1×106個細胞，用冰預冷的PBS重懸2次，1 000 r/min，4℃離心10 min，用 200 μl結合緩沖液重懸細胞，混合后，分別加入5 μl碘化丙啶(PI)和5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)-V ，在避光環(huán)境下，室溫靜置15 min ，加300 μl緩沖液，流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。

1.9Western印跡檢測細胞中酶切Caspase-3、酶切Caspase-9表達 收集轉染48 h后的骨肉瘤細胞，加入蛋白抽提試劑，放置冰上裂解20 min，4℃，12 000 r/min離心20 min。取蛋白上清液，根據BCA蛋白濃度檢測試劑盒對提取的蛋白樣品定量。取蛋白樣品與4倍上樣緩沖液按照3∶1的比例混合，100℃煮沸5 min。加入到聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中，每孔加50 μl，電泳初始電壓為80 V，觀察溴酚藍進入分離膠與濃縮膠邊緣時，調整電壓為120 V至電泳結束。取出蛋白凝膠，4℃將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，轉膜電流為220 mA。經5%脫脂奶粉37℃封閉1 h后，放在一抗(500倍稀釋，4℃過夜)、二抗(1 000倍稀釋，37℃孵育1.5 h)中反應后，滴加顯色液，以GAPDH為內參，分析蛋白表達水平。

1.10靶基因預測 利用靶基因預測軟件The miRBase(http：//www.mirbase.org/)、TargetScan(http：//www.targetscan.org/)、PicTar(http：//pictar.mdc-berlin.de/)預測miR-375 的靶基因可能為特化蛋白(Sp)1。通過常規(guī)方法構建野生型(wt)-Sp1和突變型(mut)-Sp1熒光素酶基因載體，分別將這兩種質粒與miR-375 mimics、mimics control混合共同轉染到骨肉瘤細胞中，分別計為wt+miR-375 mimics、mut+miR-375 mimics、wt+陰性對照、mut+陰性對照。放置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，利用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測雙熒光素酶活性。同時用RT-PCR和Western印跡檢測過表達miR-375后的骨肉瘤細胞中Sp1的水平，步驟同1.5，1.9。

1.11統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-375在骨肉瘤組織中的表達 骨肉瘤組織中miR-375的表達水平(0.19±0.21)明顯低于瘤旁組織(0.52±0.16)，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.84，P<0.01)。

2.2轉染后細胞中miR-375表達 陰性對照組中miR-375表達水平(0.98±0.12)與空白對照組(1.00±0.08)相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-375 mimics組(1.52±0.20)與空白對照組相比明顯升高(P<0.01)。

2.3各組細胞增殖及堿性磷酸酶比較 陰性對照組細胞存活率(98.82%±5.20%)及堿性磷酸酶活性〔(2.30±0.30)金氏單位/g〕與空白對照組〔99.80%±1.20%,(2.32±0.20)金氏單位/g〕相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-375 mimics組細胞存活率(58.23%±12.3%)與空白對照組相比明顯降低(P<0.01)。miR-375 mimics組細胞堿性磷酸酶活性〔(4.17±1.5)金氏單位/g〕與空白對照組相比明顯升高(P<0.01)。

2.4細胞凋亡檢測結果 陰性對照組細胞凋亡率及細胞中酶切Caspase-3、酶切Caspase-9與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-375 mimics組與空白對照組和陰性對照組相比明顯升高(P<0.05)。見表1，圖1。

2.5靶基因預測結果 見圖2。wt+miR-375 mimics熒光素酶活性〔(4.92±1.25)金氏單位/g〕明顯低于mut+miR-375 mimics〔(10.33±1.74)金氏單位/g,P<0.01〕。miR-375 mimics組細胞中Sp1 mRNA及Sp1蛋白表達(0.49±0.31，0.10±0.24)均明顯低于空白對照組(0.98±0.02、0.63±0.09)和陰性對照組(0.92±0.11、0.59±0.13)，見圖3。

表1 各組細胞凋亡率、酶切Caspase-3、9比較

與空白對照組比較:1)P<0.05;與陰性對照組比較:2)P<0.05

圖1 Western印跡結果圖

圖2 miR-375 靶基因預測結果

圖3 Western印跡結果

3 討 論

miRNA是一種單鏈非編碼的小分子RNA，能夠通過作用于靶基因影響細胞生長。miRNA廣泛存在于真核生物體內，具有廣泛的生物學作用〔8〕。近年來研究表明，miRNA與腫瘤的發(fā)生有關〔9〕。不同的miRNA對腫瘤的作用不同，在腫瘤組織中表達缺失或下調的miRNA發(fā)揮抑制癌癥發(fā)展的作用，在腫瘤組織中表達上調的miRNA在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮促進作用〔10〕。miR-375是一種與腫瘤相關的miRNA，在胰島素分泌、葡萄糖代謝、神經元細胞分化、肺組織活性物質分泌等過程中均有重要作用〔11〕。研究表明，miR-375與腫瘤的生長有關，在宮頸癌、前列腺癌、喉鱗癌、胃癌等多種癌癥組織中表達異常下調〔12〕。上調宮頸癌細胞中miR-375的表達水平能夠抑制宮頸癌細胞的增殖，促進宮頸癌細胞凋亡〔13〕。后續(xù)研究表明，miR-375同樣能夠抑制喉鱗癌、前列腺癌、胃癌等多種癌細胞生長〔14〕。結果與之前的研究結果一致。

癌細胞的增殖和凋亡是一個復雜的過程，受到細胞內多種信號因子的共同作用。Caspase蛋白家族是目前公認的與細胞凋亡有關的蛋白家族〔15〕。Caspase-3是Caspase級聯(lián)反應中的凋亡執(zhí)行因子，Caspase-3活化后標志著細胞凋亡進入不可逆階段〔16〕。Caspase-9是Caspase級聯(lián)反應中關鍵的信號轉導因子，活化后的Caspase-9能夠將凋亡信號傳遞給信號通路下游，引起細胞凋亡發(fā)生〔17，18〕。本研究結果提示，過表達miR-375能夠促進骨肉瘤細胞凋亡。

堿性磷酸酶是成骨細胞分化的早期標志，而骨肉瘤是由于正常成骨細胞分化異常減少導致的疾病〔19〕。本研究結果提示，miR-375能夠逆轉成骨細胞分化中斷，使正常的成骨細胞分化繼續(xù)發(fā)生。miRNA能夠通過作用于靶基因影響細胞的生物學活性〔20〕。本研究結果提示，miR-375負調控靶基因Sp1。

綜上，miR-375在骨肉瘤組織中表達下調。miR-375通過靶向Sp1促進骨肉瘤細胞正常成骨分化，促進骨肉瘤細胞凋亡，抑制骨肉瘤細胞增殖。