鄧愛民 李建華

(鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 鄭州 450064)

目前，針對(duì)肝癌最有效的治療方法是手術(shù)治療〔1〕，然而85%的患者在診斷時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，單純的手術(shù)切除甚至肝臟移植都不能獲得很好的治療效果〔2〕。MicroRNA(miRNAs)為單鏈非編碼小分子RNA，通過與靶基因互補(bǔ)結(jié)合抑制基因的蛋白翻譯或者降解mRNA使基因的表達(dá)水平下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔3〕。同樣，許多miRNAs在肝癌的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。比如miR-135a通過作用于FOXO1促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程〔4〕。而miR-300在骨肉瘤和胃癌組織中均有較高的表達(dá)水平，在骨肉瘤中miR-300通過靶向下調(diào)溴含蛋白質(zhì)(BRD)7參與腫瘤的增殖和侵襲過程，但是關(guān)于miR-300在肝癌中發(fā)揮作用的研究較少。本文運(yùn)用肝癌細(xì)胞系HepG2和Hep3b，探討miR-300對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，并通過過表達(dá)實(shí)驗(yàn)判斷miR-300的靶基因BRD7是否參與該過程。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與質(zhì)粒 人肝癌細(xì)胞系HepG2、Hep3b和人胚腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，其中HepG2和Hep3b生長(zhǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中〔含10%滅活胎牛血清(FBS)、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 μg/ml)、2 mmol/L L-谷氨酰胺〕。293T細(xì)胞生長(zhǎng)于10% FBS DMEM培養(yǎng)基中。內(nèi)參質(zhì)粒為海腎熒光素酶的質(zhì)粒pRL-TK，購自美國(guó) Promega 公司。pGL3-control報(bào)告質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室提供，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)室將質(zhì)粒(序列為BRD7 3′UTR)插入pGL3-control蟲熒光素酶序列下游，測(cè)序后命名為pGL3-BRD7 3′UTR。miRNAs定量引物(廣州銳博生物科技公司)。上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成miR-300模擬物(mimic)和陰性對(duì)照(NC)。

1.2熒光素酶實(shí)驗(yàn) 將293T細(xì)胞(規(guī)格為2×104個(gè)/孔)接種于48孔板，同時(shí)加入0.2 ml DMEM培養(yǎng)基孵育。次日，根據(jù)LipofectamineTM 2000(Invitrogen，CA，USA)說明書在293T細(xì)胞內(nèi)將miR-300 mimic和NC分別與pGL3-control或pGL3-BRD7 3′UTR及pRL-TK質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，應(yīng)用GLOMAX多功能酶標(biāo)儀分析熒光素酶。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)miRNAs的表達(dá) 于實(shí)驗(yàn)前1 d在6孔板中鋪入5×104HepG2和Hep3b，次日細(xì)胞貼壁，細(xì)胞匯合度在60%～70%，依據(jù)LipofectamineTM 2000說明書操作，將miR-300 mimic和NC分別轉(zhuǎn)染入HepG2和Hep3b細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，Trizol試劑提取總RNA，按照SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)說明書建立反轉(zhuǎn)錄體系，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)的操作由ABI7300定量PCR儀完成。所用引物序列見表1。反應(yīng)溫度： 95℃ 30 s 預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 31 s 循環(huán)40次。Ct值按照Applied Biosystem公司 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User Bulletin #2推薦方法獲得，并進(jìn)行計(jì)算，比較目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平。采用Real-Time PCR儀器(ABI公司，型號(hào)：7900)進(jìn)行分析，結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.4Western印跡檢測(cè) 在293T細(xì)胞中完成miR-300 mimic和NC的轉(zhuǎn)染過程，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，完成Western印跡實(shí)驗(yàn)。將200 μg/孔加入酶標(biāo)板中，在電壓恒定為60 V的條件下，電泳0.5 h，當(dāng)?shù)鞍走M(jìn)入分離膠后，在電壓恒定為110 V的條件下，電泳1.5 h，然后在電流恒定為80 mA的條件下，將蛋白轉(zhuǎn)膜100 min至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后用 5%脫脂牛奶37℃封閉 1 h，Tris鹽酸緩沖液(TBS-T)洗 5 min，洗1 次；加入以抗體稀釋液 1∶1 000配制的鼠抗人BRD7(Santa Cruz,USA)抗體4℃ 過夜，TBS-T洗 10 min共3次； 加入抗體稀釋液 1∶4 000配制的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37℃作用1 h，使用TBS-T清洗3次，每次10 min，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)熒光度。使用抗體稀釋液 1∶1 000配制的抗α-tubulin作為一抗，二抗為抗體稀釋液 1∶4 000 配制的 HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG。

1.5CCK-8增殖實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前24 h，在HepG2和Hep3b細(xì)胞完成miR-300 mimic和NC的轉(zhuǎn)染過程，第2天在96孔板中接種胰酶消化細(xì)胞(3 000個(gè)/孔)，CO2培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為37℃，濃度為5%，培養(yǎng)5 d內(nèi)每天每孔中加入10 μl CCK-8，培養(yǎng)1 h，空白孔作為對(duì)照，調(diào)零，波長(zhǎng)設(shè)置為450 nm，采用Bioteck DR-3506全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)量OD值。

1.6Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn) RPMI1640 混合液〔2份基質(zhì)膠(BD Biosciences，USA)和1份RPMI1640 培養(yǎng)基〕置于冰上。24 孔板中加入Transwell 小室(Merck Millipore,Darmstadt,德國(guó))，在每個(gè)小室中加入RPMI-1640 混合液，體積為60 μl，將500 μl 10%FBS RPMI1640培養(yǎng)基加入下室，CO2培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為37℃，濃度為5%，培養(yǎng)5 h。使用RPMI1640培養(yǎng)基配制成細(xì)胞懸液(5×105個(gè)/ml)消化轉(zhuǎn)染有miR-300 mimic和NC的細(xì)胞。將200 μl 細(xì)胞懸液加入小室內(nèi)，平行做3次。把24孔板放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6 h和12 h后進(jìn)行小室染色固定，應(yīng)用CARL ZEISS LSM 510顯微鏡計(jì)數(shù)，通過統(tǒng)計(jì)下室的細(xì)胞數(shù)量評(píng)估細(xì)胞侵襲狀態(tài)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1過表達(dá)miR-300促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖 將miR-300 mimic和NC分別轉(zhuǎn)染入HepG2和Hep3b細(xì)胞，qRT-PCR首先檢測(cè)miR-300的表達(dá)水平，與轉(zhuǎn)染NC比較，轉(zhuǎn)染miR-300 mimic后，HepG2和Hep3b細(xì)胞中miR-300的表達(dá)水平均上升〔(4.30±0.61)vs(1.00±0.30)，(5.60±0.30)vs(1.00±0.25)〕，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.521，20.403；P=0.001，0.000)。接著進(jìn)行CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)第3、4、5天，轉(zhuǎn)染miR-300 mimic組HepG2細(xì)胞的增殖能力與NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同樣，在實(shí)驗(yàn)第3、4、5天，轉(zhuǎn)染miR-300 mimic組Hep3b細(xì)胞的增殖能力與NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示過表達(dá)miR-300后細(xì)胞的增殖能力明顯高于對(duì)照組。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)過表達(dá)miR-300促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖

與NC組比較：1)P<0.05,與第1天比較：2)P<0.05

2.2過表達(dá)miR-300促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲 Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞在6 h或12 h侵襲到小室底部的細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染miR-300 mimic組多于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同樣，Hep3b細(xì)胞在6 h或12 h侵襲到小室底部的細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染miR-300 mimic組多于NC組(P<0.05)，提示過表達(dá)miR-300明顯促進(jìn)HepG2和Hep3b細(xì)胞的侵襲能力。見表3。

表3 培養(yǎng)不同時(shí)間過表達(dá)miR-300促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲

與6 h比較：1)P<0.05

2.3miR-300靶向作用于BRD7 熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-300能顯著抑制pGL3-BRD7 3′UTR蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的活性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。進(jìn)一步通過將miR-300 mimic與NC分別轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，利用Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BRD7的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC相比，轉(zhuǎn)染miR-300 mimic后的293T細(xì)胞中BRD7的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，見圖1，提示miR-300通過直接靶向BRD7并抑制其表達(dá)。

2.4過表達(dá)BRD7抑制肝癌細(xì)胞的增殖過程 為了說明BRD7是否參與miR-300促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖過程，將BRD7質(zhì)粒及對(duì)照分別轉(zhuǎn)染入過表達(dá)NC和miR-300 mimic的HepG2和Hep3b細(xì)胞中進(jìn)行CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)。在HepG2組中，第3、4、5天，miR-300 mimic+對(duì)照質(zhì)粒組細(xì)胞增殖能力與NC+對(duì)照質(zhì)粒組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而第3、4、5天，NC+對(duì)照質(zhì)粒組細(xì)胞增殖能力均高于NC+BRD7組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且第3、4、5天，miR-300 mimic+對(duì)照質(zhì)粒組細(xì)胞增殖能力與miR-300 mimic+BRD7組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而Hep3b中CCK-8的結(jié)果與HepG2的結(jié)果一致。以上結(jié)果說明過表達(dá)BRD7后能明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力。見表5。

表4 miR-300靶向作用于BRD7比較

圖1 Western印跡檢測(cè)BRD7蛋白表達(dá)水平

表5 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)過表達(dá)BRD7抑制肝癌細(xì)胞的增殖過程

整體分析為兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析；組間兩兩比較為L(zhǎng)SD-t檢驗(yàn)；1)2)3)分別為與NC+對(duì)照質(zhì)粒組，NC+BRDT組，miR-300 mimic+對(duì)照質(zhì)粒組比較：P<0.05；時(shí)間兩兩比較為差值t檢驗(yàn)；與第1天比較：4)P<0.05

2.5過表達(dá)BRD7抑制肝癌細(xì)胞的侵襲過程 為了說明BRD7是否參與miR-300促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲過程，在轉(zhuǎn)染入NC和miR-300 mimic的細(xì)胞HepG2中分別過表達(dá)BRD7質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒，進(jìn)行Matrigel 侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，無論6 h還是 12 h，過表達(dá) BRD7 后HepG2細(xì)胞的遷移能力均明顯減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同樣，無論6 h還是12 h，過表達(dá) BRD7后Hep3b細(xì)胞的侵襲能力均明顯減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示miR-300通過靶向BRD7促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲能力。見表6。

表6 培養(yǎng)不同時(shí)間過表達(dá)BRD7抑制肝癌細(xì)胞的侵襲過程

整體分析為兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析；組間兩兩比較為L(zhǎng)SD-t檢驗(yàn)；1)2)3)分別為與NC+對(duì)照質(zhì)粒組，NC+BRD7組，miR-300 mimic+對(duì)照質(zhì)粒組比較：P<0.05；時(shí)間兩兩比較為差值t檢驗(yàn)；與12 h比較：4)P<0.05

3 討 論

從肝炎病毒感染到肝癌的發(fā)生包括一系列過程，如病毒導(dǎo)致持續(xù)的肝損傷發(fā)展為肝硬化、肝衰竭最后發(fā)展為肝癌〔5〕。證據(jù)表明，miRNAs在腫瘤發(fā)生的早期至晚期過程中都發(fā)揮重要作用〔6〕。許多特征性的miRNAs表達(dá)譜在肝臟疾病中發(fā)生變化。而對(duì)這些miRNAs作用的深入研究將為miRNAs作為腫瘤診斷、分期、預(yù)后等潛在的非侵入性的生物標(biāo)記提供理論基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-300可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲過程，且驗(yàn)證了BRD7為miR-300的靶基因，當(dāng)過表達(dá)BRD7時(shí)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲過程受到抑制。以上結(jié)果得出結(jié)論：miR-300通過靶向BRD7促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲過程。

研究表明，miR-300同時(shí)具有促癌及抑癌作用〔7,8〕。miR-300在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，過表達(dá)miR-300可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新、增殖〔9〕。而在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中和乳腺癌中miR-300表達(dá)水平較低〔10〕，過表達(dá)miR-300可以阻止乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。但在本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-300具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖與侵襲的作用，驗(yàn)證了BRD7為miR-300的靶基因，BRD7屬于BRD家族，在心臟、肺、結(jié)腸和乳腺等多種組織中普遍表達(dá)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BRD7定位于細(xì)胞核中，可與乙?；M蛋白H3結(jié)合，從而調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑。BRD7在結(jié)腸癌和鼻咽癌中表達(dá)水平較低，過表達(dá)BRD7通過細(xì)胞周期阻滯抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖〔11〕；另外的研究表明，BRD7抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖；而敲低BRD7可以促進(jìn)p85α在細(xì)胞質(zhì)聚集，從而穩(wěn)定p110的表達(dá)水平，促進(jìn)PI3K信號(hào)通路的激活〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-300可以靶向下調(diào)BRD7的蛋白水平，而過表達(dá)BRD7可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲過程，該發(fā)現(xiàn)與BRD7為抑瘤基因的結(jié)果一致，但miR-300是否通過抑制BRD7的表達(dá)間接激活PI3K信號(hào)通路發(fā)揮該作用仍需進(jìn)一步研究。