周曉晶 李 晶 于江波 王永彬 李 欣 邢日新 明容美 張文風(fēng)

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130017)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是最常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，患病率為30%～90%〔1〕。它是一種復(fù)雜的進(jìn)行性神經(jīng)功能障礙，表現(xiàn)為遠(yuǎn)端周圍神經(jīng)對(duì)稱性退化，出現(xiàn)間歇性持久的肢體疼痛和喪失感覺(jué)等癥狀。隨著病情的發(fā)展，出現(xiàn)糖尿病潰瘍和非創(chuàng)傷性截肢〔2〕，據(jù)統(tǒng)計(jì)臨床50%～70%的非創(chuàng)傷性截肢均由其引起，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)即高血糖時(shí)產(chǎn)生的非正常糖代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已明確其可積聚于周圍神經(jīng)組織，與其受體結(jié)合啟動(dòng)下游信號(hào)通路干擾正常神經(jīng)元的功能，從而造成神經(jīng)損傷〔3〕。文獻(xiàn)報(bào)道乙二醛酶Ⅰ(GLO1)為AGEs生成的上游開關(guān)，可將多余的糖轉(zhuǎn)化為乙二醛(MD)，從而減少AGEs生成〔4〕。臨床研究已發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸四逆湯能有效改善DPN患者主觀神經(jīng)癥狀，改善膝、跟腱反射及神經(jīng)傳導(dǎo)速度〔5〕。本研究以GLO1為靶點(diǎn)，研究當(dāng)歸四逆湯能否通過(guò)調(diào)節(jié)GLO1含量及活性來(lái)防治DPN，進(jìn)一步明確DPN的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立 雄性Wistar大鼠40只，體重(240±20)g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(吉)2016-0003。大鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng)于無(wú)特殊病原菌(SPF)條件下。喂養(yǎng)1 w、禁食12 h，于左下腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(STZ，50 mg/kg)，72 h后尾靜脈取血測(cè)血糖，血糖≥16.7 mmol/L的大鼠為模型鼠。

1.2分組及給藥 造模3 d后將模型鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，即模型組、中藥組、西藥組。另取10只正常大鼠設(shè)為正常組。模型組、正常組大鼠給予生理鹽水灌胃；中藥組大鼠給予熬制的當(dāng)歸四逆湯7.44 g·kg-1·d-1灌胃，西藥組以100 mg·kg-1·d-1氨基雙胍灌胃，干預(yù)8 w。每天稱量體重及監(jiān)測(cè)血糖。

1.3取材及檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1檢測(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度 給藥8 w后，各組大鼠腹腔注射20%烏拉坦(5 ml/kg)麻醉，俯臥固定分離坐骨神經(jīng)。檢測(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度：利用Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)來(lái)測(cè)定坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度(MCV)和感覺(jué)傳導(dǎo)速度(SCV)。刺激點(diǎn)位于坐骨結(jié)下，記錄電極位于離刺激點(diǎn)2 cm處，刺激量從較小開始，逐漸增強(qiáng)到超強(qiáng)刺激。神經(jīng)傳導(dǎo)速度以復(fù)合動(dòng)作電位出現(xiàn)的潛伏期與傳導(dǎo)的距離比值來(lái)表示。

1.3.2檢測(cè)坐骨神經(jīng)形態(tài)變化 給藥8 w后，分離大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)，檢測(cè)坐骨神經(jīng)形態(tài)變化。病理形態(tài)檢測(cè)：坐骨神經(jīng)放入10%甲醛溶液中固定，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟、石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為4 μm，HE染色，進(jìn)行光鏡下病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

1.3.3分光光度法檢測(cè)坐骨神經(jīng)GLO1活性 將坐骨神經(jīng)超聲勻漿，勻漿液4℃放置40 min，低溫離心10 000 r/min離心15 min，取上清，用Lorry法測(cè)上清中蛋白濃度，繼而測(cè)GLO1活性。

1.3.4熒光定量PCR法檢測(cè)GLO1 mRNA的表達(dá) 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，利用引物擴(kuò)增GLO1，以GADPH做內(nèi)參，引物序列：GAPDH上游引物5′-CCATgTACgTAgCCATCC-3′,下游引物5′-AACCgCTCATTgCCgATAg-3′;GLO1上游引物5′-ATCTTgAACgAACgCCAgAC-3′,下游引物5′-gggATTgCTCCTgATgT-3′。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。利用2-△△CT值來(lái)比較各目的基因的mRNA表達(dá)情況。

1.3.5Western印跡法檢測(cè)GLO1蛋白的表達(dá) 于4℃下，利用細(xì)胞裂解液勻漿坐骨神經(jīng)，提取總蛋白。用Lorry法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。每孔加入20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，加封閉液于室溫下封閉2 h，加入兔抗鼠抗體(美國(guó)Sigma公司)和GAPDH多克隆抗體，37℃孵育2 h，洗膜后加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，37℃孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1當(dāng)歸四逆湯對(duì)DPN大鼠體重和血糖的影響 與正常組相比，各組大鼠體重明顯減輕(P<0.01)，血糖均明顯升高(P<0.01)；與模型組及西藥組相比，中藥組大鼠體重明顯增加、血糖明顯降低(P<0.05)。表明當(dāng)歸四逆湯明顯改善糖尿病大鼠的體重和血糖，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體重及血糖變化

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組及西藥組比較：2)P<0.05

2.2當(dāng)歸四逆湯對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)病理形態(tài)的影響 正常組坐骨神經(jīng)縱切表現(xiàn)為有髓神經(jīng)纖維排列緊密，髓鞘組織正常，施萬(wàn)細(xì)胞散在髓鞘邊緣；橫切髓鞘內(nèi)軸突清晰可見(jiàn)。模型組坐骨神經(jīng)縱切表現(xiàn)為神經(jīng)纖維腫脹，鞘細(xì)胞減少；橫切表現(xiàn)為神經(jīng)外膜毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分軸突消失。西藥組坐骨神經(jīng)出現(xiàn)部分神經(jīng)纖維腫脹，鞘細(xì)胞數(shù)目減少，大部分髓鞘溶解。中藥組坐骨神經(jīng)表現(xiàn)為神經(jīng)中可見(jiàn)到少數(shù)正常髓鞘，鞘細(xì)胞數(shù)目增多，髓鞘中可見(jiàn)正常軸突。說(shuō)明當(dāng)歸四逆湯對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)具有明顯保護(hù)作用，見(jiàn)圖1。

2.3當(dāng)歸四逆湯對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響 與模型組相比，各組坐骨神經(jīng)MCV和SCV都明顯升高(P<0.01)，說(shuō)明當(dāng)歸四逆湯和彌可保都能提高糖尿病大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度。但西藥組神經(jīng)傳導(dǎo)速度與正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而中藥組與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明雖然當(dāng)歸四逆湯與彌可保都能提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度，但是當(dāng)歸四逆湯的效果更好，神經(jīng)傳導(dǎo)速度接近于正常水平，見(jiàn)表2。

圖1 各組坐骨神經(jīng)病理形態(tài)觀察(HE，×40)

表2 各組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度變化

與模型組比較：1)P<0.01；與正常組比較：2)P<0.05，下表同

2.4當(dāng)歸四逆湯對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)中GLO1活性、蛋白表達(dá)及mRNA水平的影響 與正常組相比，模型組坐骨神經(jīng)中的GLO1酶活性、蛋白表達(dá)及mRNA水平明顯降低(P<0.05)，而中藥組均顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，中藥組坐骨神經(jīng)中的GLO1酶活性、蛋白表達(dá)及mRNA水平增加更為明顯(P<0.01)，說(shuō)明當(dāng)歸四逆湯能夠增強(qiáng)GLO1活性，上調(diào)其蛋白和mRNA表達(dá)，見(jiàn)圖2，表3。

圖2 各組坐骨神經(jīng)內(nèi)GLO1蛋白及mRNA水平

表3 各組大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)GLO1的變化

3 討 論

現(xiàn)已公認(rèn)高糖時(shí)造成AGEs積聚，AGEs與其受體RAGE結(jié)合啟動(dòng)的下游信號(hào)通路在DPN發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。如果能降低AGEs水平，將會(huì)切斷后續(xù)的信號(hào)通路，從而可以阻止周圍神經(jīng)病變。那么如何降低AGEs水平呢？我們還需追溯AGEs產(chǎn)生的原因及過(guò)程。如前所述AGEs是高血糖狀態(tài)下產(chǎn)生的非正常糖代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生主要有兩條途徑，其中重要的產(chǎn)生途徑為通過(guò)高糖產(chǎn)生的活性二羰基如3-脫氧葡萄糖、乙二醛、甲基乙二醛或α-羰基醛與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸結(jié)合而成的〔6〕。要控制AGEs的生成需切斷此途徑，減少活性二羰基或α-羰基醛生成AGEs的機(jī)會(huì)?；诖宋覀兛梢园涯抗饧杏谝叶┟赶到y(tǒng)，該酶系統(tǒng)包括GLO1和GLO2，可將有糖化活性的活性二羰基和α-羰基醛催化生成相應(yīng)的無(wú)糖化活性的酸，減少AGEs的生成〔7，8〕。其中GLO1是α-羰基醛代謝系統(tǒng)的限速酶，能防止活性二羰基在細(xì)胞內(nèi)的堆積進(jìn)而產(chǎn)生AGEs，被認(rèn)為是防止AGEs形成的關(guān)鍵酶〔4〕，因此提高GLO1含量及活性可減少AGEs的生成切斷AGEs/RAGE信號(hào)通路，從而降低由此信號(hào)通路導(dǎo)致的DPN。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸四逆湯對(duì)DPN大鼠的抑制作用或許是通過(guò)增強(qiáng)GLO1活性及表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。