郭紅艷 高 涵 吳 琦 孫曉杰 劉秀財(cái) 趙立群

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

乳腺癌的分子診斷與靶向治療是近年研究的主要方向〔1,2〕，血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶(SGK)3是PI3K信號(hào)通路中的下游分子，與Akt 平行，SGK3與多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，正逐漸成為腫瘤研究領(lǐng)域的新靶點(diǎn)〔3～6〕。SGK3高表達(dá)可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖、抑制其凋亡〔7〕，SGK3在乳腺癌組織中的表達(dá)高于正常組織，且與雌激素受體(ER)表達(dá)相關(guān)。本文在細(xì)胞水平觀察SGK3過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231惡性生物學(xué)能力的影響，并利用組織芯片檢測(cè)SGK3在不同臨床病理TNM分級(jí)的浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)并分析其與某些臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供，pEGFP-N1-SGK3重組質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建，乳腺癌組織芯片(BR1503d)購(gòu)Alenabio公司，SGK3抗體購(gòu)自Proteintech公司，UltraSensitiveTMSP超敏試劑盒為Maixin Bio公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板為Nunc公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 利用酶切鑒定、DNA測(cè)序等確定成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1-SGK3，將其和空載體pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，細(xì)胞分為MDA-MB-231組；轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1組，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SGK3組。

1.3劃痕實(shí)驗(yàn) 參考Feng等〔8〕方法，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞按每孔1×105植于6孔培養(yǎng)板上，細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%匯合，形成單細(xì)胞層，用無(wú)菌20 μl槍尖在單層細(xì)胞劃痕(每孔劃2條)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗掉脫壁細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)，分別在劃痕后0、12和24 h顯微鏡下照相監(jiān)測(cè)，觀察劃痕的修復(fù)情況。

1.4細(xì)胞周期分析 參考Pan等〔9〕方法，細(xì)胞培養(yǎng)48 h，0.25%胰酶消化處理各組培養(yǎng)細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，用冰預(yù)冷的PBS洗兩次，PBS懸浮細(xì)胞，PI染色，30 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，標(biāo)準(zhǔn)程序用FACS(Becton-Dickinson，USA)檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處的紅色熒光，資料經(jīng)ModFitL T 軟件分析。

1.5不同TNM分期浸潤(rùn)性乳腺癌SGK3的表達(dá) 組織芯片(BR1503d)浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌60例，共計(jì)120點(diǎn)，T1級(jí) 8點(diǎn)、T2級(jí)82點(diǎn)(T2N0 50點(diǎn)，T2N1 20點(diǎn)，T2N2 12點(diǎn))、T3級(jí)16點(diǎn)、T4級(jí)14點(diǎn)，免疫組化方法進(jìn)行檢測(cè)，光鏡下SGK3表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃色，Imagepro-PLus軟件測(cè)定IOD值、分析同一類型、不同TNM分級(jí)乳腺癌中SGK3的表達(dá)情況。

1.6SGK3在孕激素受體(PR)-和PR+乳腺癌組織中的表達(dá) 組織芯片樣本浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中PR+30點(diǎn)，PR-89點(diǎn)，免疫組化方法檢測(cè)組織中SGK3表達(dá)，用Imagepro-PLus軟件測(cè)定IOD值、分析PR-與PR+的乳腺癌組織中SGK3的表達(dá)情況。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、LSD、Dunnettt檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MDA-MB-231細(xì)胞遷移 MDA-MB-231親本細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞在劃痕12 h后創(chuàng)傷口變化與0 h差異不大，遷移速度緩慢，但此時(shí)，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-SGK3細(xì)胞傷口部分愈合；在劃痕后24 h，前兩組細(xì)胞傷口尚未愈合，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-SGK3細(xì)胞傷口已經(jīng)基本愈合，可見(jiàn)SGK3表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲(P<0.05)，見(jiàn)圖1和表1。

圖1 劃痕后不同時(shí)間點(diǎn)SGK3過(guò)表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響(×40)

表1 各組劃痕后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞遷移能力比較

與MDA-MB-231比較：1)P<0.05，與pEGFP-N1比較：2)P<0.05，表2同

2.2細(xì)胞周期 各組細(xì)胞在細(xì)胞周期G1、G2、S期的比例大致相近，無(wú)明顯差異；但SGK3過(guò)表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡比例卻明顯減少(P<0.01)，表明SGK3的表達(dá)能夠抑制MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，見(jiàn)表2和圖2。

表2 各組細(xì)胞周期和凋亡比較

2.3不同TNM分級(jí)浸潤(rùn)性乳腺癌SGK3的表達(dá) T1～T4的浸潤(rùn)性乳腺癌中SGK3的表達(dá)(315.11±54.31、354.56±10.85、281.74±88.11、334.51±84.88)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)而針對(duì)同一T級(jí)不同淋巴轉(zhuǎn)移情況(N0～N2)的浸潤(rùn)性乳腺癌組織SGK3表達(dá)(T2N0 375.11±117.11、T2N1 295.36±123.94、T2N2 306.12±106.08)亦無(wú)明顯差異(圖3)。

圖2 SGK3過(guò)表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期、凋亡的影響

圖3 不同TNM分級(jí)浸潤(rùn)性乳腺癌SGK3表達(dá)(×40)

2.4SGK3在PR-和PR+乳腺癌組織中的表達(dá) PR+的浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中SGK3表達(dá)與PR-組織(340.07±127.12、336.45±104.32)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖4 SGK3在PR-和PR+乳腺癌組織中的表達(dá)(免疫組化，×40)

3 討 論

SGK3可以作為肝癌治療的靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)志物〔10〕，課題組近年來(lái)對(duì)SGK3與乳腺癌的相關(guān)性研究證實(shí)：SGK3過(guò)表達(dá)會(huì)影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為，且SGK3在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)較正常乳腺組織增高、與ER等臨床病理特征相關(guān)〔11，12〕，那么SGK3可否作為乳腺癌分子診斷和治療的指標(biāo)或靶點(diǎn)呢？本研究結(jié)果提示：SGK3過(guò)表達(dá)可促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力、抑制其凋亡，但未發(fā)現(xiàn)SGK3與TNM分級(jí)、PR密切相關(guān)。

SGK3 基因沉默與有效抑制乳腺癌的惡性生物學(xué)行為、SGK3在乳腺癌中的表達(dá)與P53、Ki67等影響乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后的臨床病理特征是否相關(guān)等要進(jìn)一步研究以確定和證實(shí)SGK3在乳腺癌診斷及靶向治療中的價(jià)值。