田沂凡 佟繼銘 馬 帥 李忠思 劉永平

(河北省中藥開發(fā)與研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北 承德 067000)

赤雹根味苦性寒，功能活血祛瘀，清熱解毒，是葫蘆科多年蔓生草本植物赤雹的成熟塊根，是我國滿族民間藥材，經(jīng)常被用于治療風(fēng)濕腰腿痛、軟組織損傷，療效顯著，而且沒有明顯毒副作用〔1〕。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種自身免疫功能障礙性疾病，以侵蝕性關(guān)節(jié)損害為主，并伴隨其他系統(tǒng)受累的慢性炎性疾病，全球成人的發(fā)病率為0.5%～1.0%〔2〕。由于目前RA病因尚未確切，患者得不到臨床治愈，經(jīng)常應(yīng)用抗風(fēng)濕藥物，幾年后會(huì)出現(xiàn)明顯的毒副作用，多數(shù)患者的病情得不到滿意控制〔3〕，研究藥效高而且毒副作用小的抗RA藥物為臨床之急需。前期研究表明，赤雹根總皂苷(TSTR)對(duì)誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠有較好的治療作用〔4，5〕，本實(shí)驗(yàn)前期研究基礎(chǔ)上，探討TSTR對(duì)AA大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α的影響。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 TSTR提取所用赤雹根，經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院趙春穎教授鑒定為葫蘆科植物赤雹的干燥塊根，TSTR由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所藥理實(shí)驗(yàn)室提取，純度為55.2%；雷公藤多苷(TG)片(安徽新隴海藥業(yè)有限公司，批號(hào) 100301)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司，批號(hào)EK0526)；弗氏完全佐劑(FCA，美國Sigma公司，批號(hào)100M8725)；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(大連寶生物工程有限公司，批號(hào)BK4501)；PCR擴(kuò)增引物(美國Invitrogen 生命技術(shù)公司，批號(hào)HB120706536)；兔抗鼠TNF-α一抗(美國Bioworld公司)；免疫組化試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器 CSR-1-30型超純水機(jī)(北京愛思泰克科技開發(fā)有限責(zé)任公司)；YXQ-LS-30 SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；DU800紫外可見分光光度計(jì)(美國Beckman Coulter公司)；iCycler PCR儀(美國Bio-rad公司)；SIM-F124制冰機(jī)(日本SANYO公司)；ESJ200-4電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)；TK-218型恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)(湖北泰維醫(yī)療科技有限責(zé)任公司)；YKH-I型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠)；RM2125型常規(guī)輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)；BH-2型Olympus顯微鏡及攝像裝置(日本Olympus公司)。

1.3動(dòng)物 SPF級(jí)，雄性8周齡SD大鼠60只，體重180～200 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào)：SCXK京2009-0007。

1.4方法

1.4.1AA模型的制備 隨機(jī)數(shù)字表法取大鼠10只作為空白組，其余大鼠均于右后足跖部皮下注射FCA 0.1 ml，以注射點(diǎn)周圍出現(xiàn)明顯白泡為效果最佳，于注射FCA后第18天，關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)≥6為模型建立成功。AI評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：肢體關(guān)節(jié)腫脹按0～Ⅳ級(jí)評(píng)分〔6〕。0級(jí)：無紅腫；Ⅰ級(jí)：指關(guān)節(jié)稍腫；Ⅱ級(jí)：小趾關(guān)節(jié)及足趾關(guān)節(jié)腫脹；Ⅲ級(jí)：踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹；Ⅳ級(jí)：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。AI=四肢肢體關(guān)節(jié)腫脹級(jí)評(píng)分之和(Ⅰ級(jí)為1分，總分為16分)。AI≥6的大鼠為模型建立成功。

1.4.2分組及給藥 將模型大鼠隨機(jī)分為模型組、TSTR 40，80，160 mg/kg組和TG 12 mg/kg對(duì)照組，各藥物組均灌胃給予相應(yīng)藥物21 d，空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。

1.4.3ELISA檢測(cè)AA大鼠血清TNF-α水平 腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min以上，3 500 r/min離心10 min，取上清，將血清注入EP管中4℃保存?zhèn)溆?。按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清TNF-α含量。

1.4.4逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR法測(cè)定足跖部TNF-α mRNA表達(dá) 取新鮮足趾100～200 mg，加入1 ml Trizol，置于勻漿器中，冰上充分研磨，勻漿液于離心機(jī)(4 ℃、 12 000 r/min，15 min)離心后，取上清液，加入0.2 ml三氯甲烷，劇烈震搖30 s，靜置5 min；同等條件再次離心后，小心吸取上清水相液(勿吸入中間蛋白層)，加入等體積異丙醇，上下緩慢顛倒幾次，使之混勻，-20℃冰箱靜置2 h后，冰上放置5 min；再次相同條件離心，留取管壁側(cè)部和底部的白色RNA沉淀，用75%乙醇〔0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水配制〕1 ml，洗滌沉淀，重復(fù)3次，將洗滌后的RNA溶于20 μl DEPC水中，放置-80℃冰箱，保存?zhèn)溆谩Ｈ∩倭看郎y(cè)RNA樣品，用DEPC水稀釋100倍，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA完整性，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?0℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min)產(chǎn)物cDNA于-20℃保存。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s(不同目的因子采用相應(yīng)的退火溫度)，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物于-20℃保存。TNF-α上游引物5′-CGTCGTAGCCAAACCACCAAG-3′，下游引物5′-CACAGAGCAATGACTCCAAAG-3′，擴(kuò)增長度426 bp，退火溫度57℃；β-actin上游引物5′-CATCCTGCGTCTGGACCT-3′，下游引物5′-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′，擴(kuò)增長度480 bp，退火溫度53℃反應(yīng)液依照試劑盒說明書配制同PCR反應(yīng)產(chǎn)物分析：配制含EB 0.5 μg/ml的2%瓊脂糖凝膠，取4 μl PCR產(chǎn)物與1 μl 5倍DNA上樣緩沖液混勻，將電泳儀調(diào)至120 V，25 min，將電泳結(jié)束后的凝膠移至紫外透射儀下，觀察并攝取圖像。應(yīng)用Quantity One4.6.2凝膠定量分析軟件測(cè)定圖像的光密度值(IOD)，進(jìn)行定量分析。計(jì)算各目的條帶與β-actin條帶光密度的比值(ROD)。

1.4.5免疫組化法測(cè)定脾臟TNF-α蛋白表達(dá)水平 將取材后的大鼠脾臟于10%甲醛固定液固定48 h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片(免疫組化步驟按試劑盒說明書進(jìn)行)、10×20倍光鏡下觀察TNF-α高蛋白表達(dá)情況，并拍攝圖像；其中以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒狀淡黃色或褐黃色者為陽性細(xì)胞。采用IPP6.0軟件測(cè)定足跖部TNF-α表達(dá)的免疫組化染色的IOD值，計(jì)算各組光密度平均值，進(jìn)行半定量分析。陰性對(duì)照片用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，其余操作步驟同上。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組血清TNF-α水平比較 模型組血清TNF-α 含量〔(0.98±0.08)ng/ml〕明顯高于空白組〔(0.15±0.03)ng/ml,P<0.01〕；TSTR 40,80,160 mg/kg組血清TNF-α 含量〔(0.56±0.05)、(0.32±0.04)、(0.18±0.04)ng/ml〕明顯低于模型組(P<0.01)；TSTR 40 mg/kg組和80 mg/kg組血清TNF-α 和TG對(duì)照組〔(0.15±0.03)ng/ml〕比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療RA效果弱于TG對(duì)照組；TSTR 160 mg/kg組血清TNF-α 和TG對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組足跖部TNF-α mRNA表達(dá)比較 各組內(nèi)參β-actin mRNA表達(dá)較為均一，空白組TNF-α mRNA表達(dá)較少(0.1±0.02)。各藥物組TNF-α mRNA表達(dá)均明顯低于模型組(0.665±0.099，P<0.05或P<0.01)；其中TSTR 40 mg/kg組(0.299±0.054)和TSTR 80 mg/kg組(0.27±0.045)大鼠TNF-α mRNA表達(dá)和TG對(duì)照組(0.162±0.036)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療RA效果弱于TG對(duì)照組；TSTR 160 mg/kg組TNF-α mRNA表達(dá)(0.077±0.01)和TG對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

A～F:空白組、模型組、TSTR 40 mg/kg組、TSTR 80 mg/kg組、TSTR 160 mg/kg組、TG對(duì)照組圖1 各組足跖部TNF-α mRNA

2.3各組脾臟TNF-α蛋白表達(dá)水平比較 與空白組(0.09±0.02)相比，模型組(1.52±0.28)脾臟TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，TSTR各劑量組TNF-α表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)；其中TSTR 40 mg/kg組和80 mg/kg組TNF-α表達(dá)水平(1.01±0.22，0.54±0.13)和TG對(duì)照組(0.39±0.11)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，治療RA效果弱于TG對(duì)照組；TSTR高劑量組TNF-α 表達(dá)(0.47±0.15)和TG對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；見圖2。

3 討 論

RA是一種以慢性、侵蝕性關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的自身免疫性疾病。目前為止，醫(yī)學(xué)界還沒有攻克RA這一世界性的難題，通常認(rèn)為與T細(xì)胞免疫反應(yīng)和B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體均有關(guān)，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。RA患者中炎性細(xì)胞因子異?；钴S已得到公認(rèn)，特別是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α與RA的發(fā)病密切相關(guān)〔7，8〕。TNF-α不僅可以通過自分泌的形式進(jìn)行細(xì)胞的調(diào)節(jié)和體液免疫，還可以通過旁分泌的形式在早期的RA中扮演著重要的角色〔9〕，肖金魚等〔10〕在RA患者滑液和血清中，檢測(cè)出TNF-α 表達(dá)水平顯著增高。在對(duì)RA模型大鼠炎癥組織的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，引起大鼠關(guān)節(jié)腫脹及滑膜損傷的重要因素是大量TNF-α 和IL-1β的表達(dá)〔11〕。TNF-α對(duì)RA滑膜細(xì)胞凋亡也有重要影響〔12，13〕，從而加重關(guān)節(jié)炎的發(fā)病。而且TNF-α對(duì)前列腺素(PG)E2和膠原酶的合成也起到了關(guān)鍵作用，能引起骨和軟骨吸收的破壞，促進(jìn)纖維細(xì)胞增生〔14〕；TNF-α的分泌對(duì)巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生也起到刺激和加速形成的作用〔15〕，巨噬細(xì)胞又通過激活關(guān)節(jié)腔血管內(nèi)皮細(xì)胞增強(qiáng)黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成釋放前列腺素和膠原酶，引發(fā)關(guān)節(jié)腔及滑膜炎癥反應(yīng)〔16〕，參與RA的免疫病理損傷過程；而軟骨基質(zhì)的崩解容易誘發(fā)TNF-α的合成，形成正反饋系統(tǒng)，加重TNF-α在RA活動(dòng)期的滑囊炎和骨損壞過程中所起的決定性作用。TNF-α還促進(jìn)炎性因子IL-1β的合成和分泌，各種炎癥因子的表達(dá)相互促進(jìn)，形成惡性循環(huán)。

RA是一種反復(fù)發(fā)作性、以肢體小關(guān)節(jié)疼痛為主要病癥的疾病，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中多把此類病癥歸為“痹證”范疇，雖然沒有RA這一病名，但是從患者體征、臨床癥狀等，可以看出古代醫(yī)家對(duì)該病認(rèn)識(shí)由來已久?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中就提出了“痹”病，如《素問·逆調(diào)論》所云“……病名曰骨痹，是人當(dāng)攣節(jié)也”。東漢張仲景在《金匱要略·痙濕暍病脈證》中指出“病者，一身盡疼，發(fā)熱，日晡所劇者，名風(fēng)濕”。古代醫(yī)家多認(rèn)為氣血不足，營衛(wèi)失調(diào)是此病發(fā)生的重要內(nèi)因，風(fēng)寒濕熱之邪是本病發(fā)生的重要外因，治療的原則多從這幾個(gè)方面辨證施治，遣方用藥。中藥雷公藤功效祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛，從雷公藤中提取制備的TG片具有較強(qiáng)的抗炎及免疫抑制作用，長期以來在用于治療RA方面療效顯著，但是近年來發(fā)現(xiàn)其毒副作用較大，尋找毒副作用小，療效顯著的抗RA藥物尤為迫切。赤雹為少數(shù)民族長期沿用藥材，課題組前期已經(jīng)證明了TSTR對(duì)大鼠AA有治療作用〔17,18〕，可以減輕大鼠AA滑膜炎癥反應(yīng)，也證實(shí)了TSTR發(fā)揮鎮(zhèn)痛的主要作用機(jī)制與抑制NO和PGE2的合成和釋放有關(guān)〔19〕，推知TSTR發(fā)揮作用的機(jī)制也可能與抑制TNF-α的活性有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證明TSTR對(duì)RA的治療可能是通過抑制TNF-α活性而發(fā)揮作用。