俞之胤 李曉華 隋 欣 楊 擎 石曉征 李 娜 韓 冬 于 澎 王 建

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117)

老年性骨質(zhì)疏松為原發(fā)性骨質(zhì)疏松疾病，主要臨床表現(xiàn)為患者骨密度(BMD)低下、骨脆性增加，常見患病人群為絕經(jīng)期婦女，是一種發(fā)病率高的全身性骨代謝疾病。人參為五加科草本植物〔1〕，活性成分包含蛋白、多肽、氨基酸、揮發(fā)油、多糖、微量元素及人參皂苷〔2～6〕，其中以人參皂苷為主要功效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。人參臨床應(yīng)用集中在抗氧化、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、抗腫瘤、提高機體免疫等〔7～13〕。人參皂苷可促進骨生長發(fā)育、預(yù)防骨質(zhì)疏松。本研究觀察人參總皂苷對大鼠體內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)、骨形成蛋白(BMP)、Smad1的調(diào)節(jié)作用，探討人參總皂苷抗骨質(zhì)疏松的治療效果和分子作用機制。

1 材料與方法

1.1動物、藥品、試劑及儀器 清潔級雌性SD大鼠，體重(200±10)g，購于長春市憶斯實驗動物有限責(zé)任公司，動物生產(chǎn)許可證：SCXK(吉)2011-0004。人參總皂苷購于長春賽信生物科技有限公司。倍美力，雌激素類藥物(購于惠氏制藥有限公司)。RNA制備試劑(天根公司)，qRT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)，蛋白裂解液(北京鼎國公司)，ALP抗體(OminmAbs公司)，考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒(上海美季生物)，Smad1抗體(美國Proteintech公司)，BMP抗體(美國Proteintech公司)。引物由長春百金生物公司代理合成。qRT-PCR儀(德國艾本德公司)；酶標(biāo)儀(瑞士帝肯公司)。X-射線骨密度儀(美國LUNAR公司)；蛋白電泳(美國通用公司)；離心機(德國艾本德公司)；核酸提取構(gòu)建儀(瑞士帝肯公司)；核酸電泳(美國伯樂公司)；恒溫水浴(美國賽墨菲公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組 隨機將60只雌性大鼠分為空白組、模型組、陽性組、人參總皂苷高、中、低劑量組?？瞻捉M大鼠進行假手術(shù)處理，剔除卵巢周圍脂肪組織，其余組大鼠均進行雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)(OVX)，建立原發(fā)性骨質(zhì)疏松大鼠模型，手術(shù)后給予1 w的青霉素治療。

1.2.2給藥 采用灌胃給藥方式，人參總皂苷低、中、高劑量組給藥量分別為20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg，陽性組給藥量為0.05 mg/kg倍美力，其余組給予等體積的生理鹽水。90 d后，脫臼處死所有動物，留取股骨備用。

1.2.3BMD測量 利用X-射線BMD儀，檢測手術(shù)前和治療結(jié)束時各組大鼠股骨BMD，比較人參總皂苷治療前后大鼠股骨BMD變化，觀察人參總皂苷防治骨質(zhì)疏松的作用效果。

1.2.4檢測ALP、BMP、Smad1表達(dá) 引物設(shè)計及總RNA制備：利用NCBI檢索大鼠ALP、BMP、Smad1的全長基因堿基序列，應(yīng)用Primer Premier 6.0軟件，設(shè)計PCR特異性引物ALP、BMP、Smad1，由長春百金生物公司提供合成服務(wù)，ALP正義鏈：ATGCCCTGAAACTCCAAA，反義鏈：TCTCCAGCCGTGTCTCCTC；BMP正義鏈：GGACTGCGGTCTCCTAAA，反義鏈：CAGCCTCAACTCAAACTCG；Smad1正義鏈：CACTATTGAAAACACCAGGCGGCAT，反義鏈：：GCTACTGTCACTAAGGCATTCGGCA；β-actin正義鏈：TTACTGCCCTGGCTCCTA，反義鏈：ACTCATCGTACTCCTGCTTG。利用磁珠法在全自動核酸構(gòu)建儀中制備總RNA，樣品溶于無菌水中。經(jīng)10%核酸電泳檢測RNA純度，觀察28 S和18 S含量，并進行質(zhì)量評價；分光光度法測定RNA濃度，并將各組RNA濃度定量為50 ng/μl。然后將各組總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real-time PCR實驗：在PCR反應(yīng)管中，依次加入SYBR Primex、cDNA模板、上游引物和下游引物；用滅菌水補至20 μl，建立RCR反應(yīng)體系。采用“兩步法”PCR擴增標(biāo)準(zhǔn)程序〔14～16〕，反應(yīng)體系為20 μl。擴增結(jié)束后統(tǒng)計CT值，應(yīng)用“2-△△Ct”法觀察人參總皂苷對ALP、BMP、Smad1 mRNA表達(dá)的調(diào)控作用。

1.2.5Western印跡實驗 總蛋白樣品的制備及定量：將儲存在-80℃條件下的股骨研磨至細(xì)粉，按固液比1∶10加入組織裂解液，轉(zhuǎn)移到離心管中，加入適量苯甲基磺酰氟(PMSF，100×)，冰浴裂解2 h。12 000 r/min、離心10 min，上清液為股骨總蛋白。采用考馬斯亮藍(lán)法制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。用純水將各組蛋白濃度定量至同一水平，進行Western印跡實驗，觀察人參總皂苷對ALP、BMP、Smad1蛋白表達(dá)的影響。免疫印跡法檢測ALP、BMP、Smad1蛋白表達(dá)：將定量后的蛋白樣品加熱變性，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳檢測。將膠片轉(zhuǎn)移至三層濾紙上，加蓋硝酸纖維素薄膜(PVDFC)膜，覆蓋3層濾紙，固定后，轉(zhuǎn)膜70～90 min。依次進行洗滌、牛奶封閉、洗滌，一抗、二抗封閉，最后進行電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色，在凝膠成像儀中觀察各組ALP、BMP、Smad1蛋白情況。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組BMD比較 手術(shù)前各組股骨BMD水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療90 d后，與空白組比較，模型組BMD顯著降低(P<0.01)，證實造模成功。治療90 d后，與模型組相比，陽性組BMD顯著升高(P<0.01)，人參總皂苷高、中劑量組BMD均增加明顯(P<0.05)，低劑量組也有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組ALP、BMP、Smad1 mRNA表達(dá)水平比較 將制備的總RNA樣品進行瓊脂糖電泳檢測，電泳結(jié)果見圖1。圖中28 S和18 S條帶清晰可見，經(jīng)比對marker，其堿基數(shù)吻合，總RNA純度高，經(jīng)過對總RNA質(zhì)量評價，基本滿足熒光定量PCR實驗要求。與空白組比較，模型組ALP、BMP、Smad1 mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性組及人參總皂苷高劑量組ALP、BMP、Smad1的mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.01，P<0.05)，中劑量組BMP mRNA表達(dá)也顯著升高(P<0.05)，且中劑量組ALP、Smad1 mRNA及低劑量組ALP、BMP、Smad1 mRNA表達(dá)有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3各組ALP、BMP、Smad1蛋白表達(dá)情況比較 與空白組比較，模型組ALP、BMP、Smad1蛋白表達(dá)均顯著下降(P<0.01)，與模型組比較，陽性組、人參總皂苷高、中劑量組ALP、BMP及Smad1蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.01，P<0.05)，低劑量組呈現(xiàn)升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表3。

表1 各組股骨BMD比較

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05,3)P<0.01；下表同

1～6：空白組、模型組、陽性組、高、中、低劑量組；M:marker圖1 各組大鼠股骨總RNA電泳圖

表2 各組ALP、BMP、Smad1 mRNA水平比較

圖2 各組ALP、BMP、Smad1蛋白表達(dá)

表3 各組ALP、BMP、Smad1 蛋白相對表達(dá)量的比較

3 討 論

BMD是目前診斷骨質(zhì)疏松的重要風(fēng)險標(biāo)記物，且利用骨密度儀照射大鼠股骨，操作簡單且數(shù)據(jù)可靠。ALP是一大類同工酶，廣泛分布于骨骼中，ALP活力的變化是臨床上檢測各類骨骼疾病的重要指標(biāo)，臨床常被用作評價骨形成和骨轉(zhuǎn)化的檢測指標(biāo)。BMP和Smad1是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β信號通路的主要成員，其中BMP是一種骨成型蛋白，作為重要的細(xì)胞因子主要游離在細(xì)胞外，起調(diào)控成骨細(xì)胞分化和骨形成的作用〔17〕。通過與其受體作用后，特異復(fù)核Smad1/5/8，進而作用細(xì)胞核內(nèi)的Smad4來調(diào)節(jié)骨代謝平衡〔18,19〕。所以初步猜想人參皂苷有調(diào)節(jié)骨代謝的作用，可能是通過調(diào)控BMP/Smad1信號通路來實現(xiàn)的。目前原發(fā)性骨質(zhì)疏松臨床診療標(biāo)準(zhǔn)明確，臨床用藥治療多集中在西藥及聯(lián)合用藥，如雙磷酸鹽類、鈣劑、VitD或K2、降鈣素、雌激素類、甲狀旁腺素類、鍶劑、雌激素受體調(diào)節(jié)劑〔20，21〕。研究者們〔22～24〕開展了補虛中藥及復(fù)方在骨質(zhì)疏松治療中的研究，證實了多種中藥或復(fù)方可能有抗骨質(zhì)疏松的作用。本研究證實人參總皂苷能改善大鼠股骨BMD，同時調(diào)控ALP、BMP、Smad1 mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平一致。證實人參提取物在防治骨質(zhì)疏松中可能發(fā)揮一定的防治作用，但具體是人參中哪種皂苷發(fā)揮作用或起主導(dǎo)作用，還需后期進行多種人參皂苷單體的篩選和驗證。為進一步闡述人參皂苷抗骨質(zhì)疏松分子作用機制，作者將利用二維電泳-質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用技術(shù)建立骨質(zhì)疏松模型組和治療組的蛋白組學(xué)分析，比較二者之間顯著差異表達(dá)的蛋白，然后利用qRT-PCR技術(shù)，驗證相關(guān)基因的差異表達(dá)，需找調(diào)控骨質(zhì)疏松的功能蛋白。并借助功能蛋白作用的信號通路闡述人參皂苷治療骨質(zhì)疏松的作用機制。