胡躍強 甘業(yè)賢 梁 妮 陳 煒 秦紅玲 唐 農

(廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

迄今為止，盡管溶栓、支架植入等血管內治療日益成熟，能顯著提高腦梗死患者的成活率，但不能使已經壞死的神經元再生。隨著骨髓間充質干細胞(BMSCs)移植和分化等技術的日漸成熟，為病損神經元的重建提供了全新策略〔1〕，但其移植后在宿主內的存活率和分化率不高，使其療效難達滿意〔2〕。而缺氧預處理(HP)作為目前提高干細胞移植效果的新興方法在許多細胞系已被證實〔3，4〕。以“濁毒”和“瘀血”為病機創(chuàng)制的清熱化瘀方，具有解毒降濁、活血化瘀的功效，前期動物實驗表明該方治療腦梗死的效果顯著〔5～7〕。本實驗通過研究清熱化瘀方聯合HP-BMSCs移植對大鼠血管內皮生長因子(VEGF)表達及血管新生的影響，旨在探討其神經保護的部分作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物與分組 健康3月齡雄性SD大鼠216只(SPF級，廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK桂2014-0002)，體重(250±50)g，隨機分為假手術組(SO)、模型組(MCAO)、BMSCs移植對照組(N-BMSCs)、經HP后的BMSCs移植組(HP-BMSCs)、BMSCs移植聯合清熱化瘀方組(BMSCs+QRHY)、HP-BMSCs移植聯合清熱化瘀方組(HP+QRHY)各36只，根據細胞移植后取材時間點(7、14、28 d)，將每組再分3個亞組(n=12)。

1.2實驗藥物及主要儀器試劑 ①實驗藥物：清熱化瘀方：水牛角30 g、丹參15 g、地龍10 g、赤芍15 g、川芎10 g、郁金10 g、石菖蒲10 g、天竺黃10 g、酒大黃6 g，給予本方濃縮顆粒劑按1.4 ml/100 g體重濃度灌胃，其濃度及等效劑量按人和動物間體表面積比值表折算。②主要試劑及儀器：L-DMEM培養(yǎng)基(上海Gibco/Hyclone公司)，優(yōu)級胎牛血清、淋巴細胞分離液 (天津灝洋生物有限公司)，兔抗VEGF(BioVision)，倒置熒光相差顯微鏡(日本OLYMPUS)，免疫組化試劑盒(北京中杉)，TUNEL試劑盒(Roche)，CD31/PECAM-1 Antibody(NB100-2284)。

1.3BMSCs的培養(yǎng)、鑒定及HP方法 ①MSCs培養(yǎng)：采用全骨髓貼壁培養(yǎng)常規(guī)方法分離獲得3周齡SD大鼠BMSCs，并按1∶3 的比例傳代培養(yǎng)，收集第4代細胞，調整其濃度為106個/ml。②BMSCs鑒定：取第4代BMSCs，加入TITC熒光標記的抗CD34、CD45、CD90抗體，予流式細胞技術檢測細胞表面抗原標記率。③HP方法：將BMSCs按1∶3 的比例傳代培養(yǎng)達80%融合，換液后進行HP，在ProOx-C-chamber系統(Biospherix，Redfield，NY，USA)中設置調控缺氧濃度為0.5%，缺氧時間24 h。

1.4動物造模及藥物干預方法 SO組線栓只插入頸內動脈9 mm；參照改良的Longa線栓法〔8〕建立腦缺血再灌注(I/R)模型，缺血2 h后拔出栓線進行再灌注；N-BMSCs和HP-BMSCs組再灌注后24 h經頸內動脈分別給予BMSCs、HP-BMSCs懸浮液200 μl，細胞數2×106個/ml，并予同等體積的生理鹽水灌胃；BMSCs+QRHY和HP+QRHY組再灌注前4 d給予清熱化瘀方顆粒劑灌胃(14 g·kg-1·d-1)，1次/d，待動物清醒后繼續(xù)灌胃。其濃度及等效劑量按人和動物間體表面積比值表折算。

1.5大鼠神經功能缺損評分(NSS) I/R大鼠NSS按改良神經功能評分法〔9〕在細胞移植各時間點處死實驗大鼠前評分，總分18分，評分越低表明神經功能損傷越輕。

1.6TUNEL法檢測缺血半暗帶細胞凋亡 參照試劑說明書進行操作。光學顯微鏡下觀察標本缺血半暗帶區(qū)域，被試劑染成棕褐色的細胞為凋亡細胞，每張切片任意選取4個視野(×400)，取平均值作為測定值并計算出陽性細胞數。

1.7Western印跡檢測缺血半暗帶VEGF蛋白表達 ①蛋白樣品收集：以蛋白裂解液常規(guī)提取各組大鼠缺血半暗帶腦組織蛋白，經勻漿離心后以聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定各組蛋白濃度；②電泳：將收集的蛋白樣品中加入5倍蛋白上樣緩沖液，變性冷卻后，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)垂直電泳進行蛋白分離(100 V)；電泳后將凝膠上的蛋白條帶電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上進行免疫反應(約80 min)；③轉膜：使用Bio-Rad轉膜裝置，將凝膠上的蛋白條帶電轉移至PVDF膜上(300 mA，120 min)；④免疫反應：于室溫下封閉1 h，經緩沖液洗膜后，加入一抗VEGF(1∶1 000)，4℃孵育過夜，次日經洗膜后加入二抗(1∶2 000)置室溫下孵育1 h；⑤蛋白檢測：化學發(fā)光劑(ECL)檢測轉印膜上靶蛋白信號，于暗室中曝光X線片，采用Alpha Ease FC圖像分析軟件對條帶進行光密度(OD)分析，以目的條帶與內參β-actin的比值表示目的蛋白表達水平。

1.8CD31免疫組化染色 取腦組織、固定、脫水、石蠟包埋，按5 μm厚度連續(xù)切片，免疫組化采用SP法。CD31/PECAM-1抗體(1∶250)，按試劑盒要求進行操作。參照文獻〔10〕，采用Imagepro-plus6.0 軟件分析免疫組化圖片，先以30倍低倍鏡找出大腦皮層缺血半暗帶3個微血管密度(MVD)最高的區(qū)域(即熱點區(qū))，再換高倍鏡(×400)計數被CD31染成陽性棕色的微血管數目，每個樣本用5個400倍視野下的血管數目的平均值表示。

1.9統計學分析 采用SPSS18.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組NSS比較 SO組未見神經功能缺損；其余各組在I/R后第7、14、28天均出現不同程度的神經功能缺損；各相同時間點相比，各移植組NSS顯著低于MCAO組，其中以HP+QRHY組減少的最為明顯(P<0.05)，見表1。

2.2各組神經細胞凋亡數比較 TUNEL法顯示，各組神經細胞凋亡均于7 d達到高峰，至14、28 d逐漸下降。MCAO組7、14、28 d細胞凋亡數仍顯著高于SO組(P<0.05或P<0.01)；與MCAO組比較，N-BMSCs、HP-BMSCs、BMSCs+QRHY、HP+QRHY組7、14、28 d細胞凋亡數顯著減少(P<0.05)；與HP-BMSCs組比較，BMSCs+QRHY、HP+QRHY組7、14 d細胞凋亡數進一步減少，以HP+QRHY組減少更為明顯(P<0.05)。見表2，圖1。

表1 各組神經功能缺損評分比較分，n=6)

1)與SO組、2)與MCAO組、3)與N-BMSCs組、4)與HP-BMSCs組、5)與BMSCs+QRHY組比較:均P<0.05

表2 各組凋亡細胞計數比較個/視野,n=6)

與SO組比較:1)P<0.01，2)P<0.05；與MCAO比較:3)P<0.05；與HP-BMSCs組比較:4)P<0.01，5)P<0.05

2.3各組MVD計數比較 CD31免疫組化結果顯示，各組缺血半暗帶區(qū)MVD計數在7 d達到高峰，14、28 d有所回落。MCAO組7、14、28 d顯著高于SO組(P<0.05)；HP-BMSCs、BMSCs+QRHY、HP+QRHY組顯著高于N-BMSCs組(P<0.05)，HP+QRHY組顯著高于HP-BMSCs組(P<0.05)。見表3，圖2。

圖1 7 d各組神經凋亡(×400)

表3 各組MVD計數比較個/mm2,n=6)

與SO組比較:1)P<0.05；與MCAO組比較:2)P<0.05；與N-BMSCs組比較:3)P<0.05；與HP-BMSCs組比較:4)P<0.05；同表4

圖2 7 d各組CD31的表達(×400)

2.4各組VEGF蛋白表達比較 Western印跡顯示，各組VEGF蛋白表達均于7 d達到高峰，至14、28 d表達逐漸下降，MCAO組7、14 d表達顯著高于SO組(P<0.05)；與MCAO組比較，N-BMSCs、HP-BMSCs、BMSCs+QRHY、HP+QRHY組7、14、28 d VEGF蛋白表達顯著增加(P<0.05)；與HP-BMSCs組比較，BMSCs+QRHY、HP+QRHY組蛋白表達進一步增加，以HP+QRHY組增加更為明顯(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 各組VEGF蛋白表達比較值,n=6)

圖3 各組VEGF蛋白表達電泳

3 討 論

BMSCs移植在臨床中的應用日益受到重視，然而在應用中也存在諸多問題，如何使其成為方便、高效的細胞制劑，是目前亟待解決的難題。近年來研究發(fā)現HP可能作為一種提高干細胞移植效果的方法而備受關注，其機制可能為激活內源性保護機制，如保護性蛋白的激活，從而提高細胞或機體的抗凋亡能力并刺激血管新生；而血管新生可改善腦組織血流、促進神經修復、清除壞死組織，成為治療急性腦卒中的關鍵〔10，11〕。目前不少體外實驗證實經HP處理的神經干細胞同樣具有協同神經保護作用〔3，12〕。BMSCs移植可促進缺血損傷區(qū)的神經功能修復，可能機制是釋放營養(yǎng)神經因子調動內源性修復機制，減少細胞壞死，促進神經和血管新生，如其能提高缺血半暗帶VEGF表達水平，從而促進新生血管生成；或者直接分化成神經細胞并在缺血損傷部分再生出神經，其能促進神經功能的恢復已得到諸多研究所證實〔10～13〕。鑒于目前BMSCs的移植研究存在諸如誘導增殖、定向分化、安全性和療效等問題，以基因修飾或用細胞因子和其他物質處理BMSCs移植又存在諸多不良反應。在血管新生的研究中，CD31又稱為血小板內皮細胞黏附分子-1，是一種內皮細胞連接分子，主要表達于內皮細胞，是現在最常用的血管內皮細胞分化的標志之一，常用于MVD的測定〔13〕，免疫組化檢測指標可作為機體血管生成的標志。VEGF又稱為血管通透性因子，在血管生成的起始階段起關鍵作用，通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3k)/蛋白激酶B(Akt)信號通路可以直接并特異地作用于血管內皮細胞，促進其分裂、增殖和遷移，促進腦梗死后新生血管和側支循環(huán)形成，達到保護腦缺血損傷的作用〔14〕。

腦卒中的核心在于“腦絡瘀阻”，其病機的核心是氣血逆亂。氣變于病之始，血變于病之成，“氣不順則為風”、“氣有余便是火”，風火相合，上犯腦髓，竄入經絡，血脈澀滯，凝而為痰，而成缺血性腦卒中。針對以上病機，本文提出“清熱解毒，化瘀通絡”的治法(簡稱清熱化瘀法)，解毒以對抗損害因素是為祛邪，通絡以暢行氣血是為扶正，并在此基礎上組建了清熱化瘀方。前期臨床研究表明本方是對腦梗死有確切療效的中藥復方制劑〔15〕，動物實驗研究表明其可促進腦梗死后神經干細胞的增殖，提高干細胞的成活率，具有較好的神經保護作用〔6，7〕。本研究首次嘗試以HP-BMSCs移植聯合清熱化瘀方來治療急性腦梗死，體現了中醫(yī)“治未病”的理念，這為中醫(yī)藥防治腦卒中提供了可供借鑒的思路和方法。

本實驗結果表明，I/R損傷大鼠經移植BMCs后神經缺損癥狀減輕，細胞凋亡減少，MVD測定計數升高，VEGF蛋白表達上調，其可能機制是通過上調VEGF的表達從而提高MVD，從而產生神經保護作用。