金梅花 崔香丹 尹學(xué)哲 全吉淑

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133000)

祁州漏蘆是菊科植物Rhaponticum uniflorum(L.) DC.的干燥根〔1〕，具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗衰老、抗炎等藥理作用〔2～5〕。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，祁州漏蘆能預(yù)防多種因素引起的肝損傷，并抑制小鼠H22移植瘤生長(zhǎng)〔6～8〕。本文主要探討祁州漏蘆水提物(RUWE)對(duì)癌前病變初期大鼠肝臟標(biāo)志酶及肝臟抗氧化酶的影響。

1 材料與方法

1.1試劑 乙酰氨基芴(AAF)和二乙基亞硝胺(DEN，Sigma公司)；γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)P、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)及過氧化氫酶(CAT)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)；兔GGT多克隆抗體及小鼠GSTP單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。

1.2藥物 將祁州漏蘆切碎，加水煎煮，減壓蒸餾即得RUWE，主要成分為多糖(81%)和甾酮(13%)〔5〕。

1.3動(dòng)物分組與處理 將Wistar大鼠(雄性，體重150～180 g)隨機(jī)分為對(duì)照組(假手術(shù)組)、模型組和RUWE組。改良Solt-Farber法復(fù)制大鼠肝癌前病變模型〔4～6〕，即第1周一次性腹腔注射200 mg/kg DEN啟動(dòng)化學(xué)誘癌過程；第3周末施行2/3肝切除術(shù)，并從第3周開始飼喂0.008% AAF，持續(xù)到第8周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束為止，以完成促癌過程。RUWE組第3周開始飼喂0.008% AAF和100 mg/kg RUWE，持續(xù)至第8周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束；對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，第3周末施行肝切除術(shù)。

1.4取材及血清指標(biāo)測(cè)定 第8周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將各組大鼠麻醉后心臟采血并分離血清，按測(cè)試盒操作方法測(cè)定血清GGT、ALT、AST活性。

1.5肝組織病理及生化指標(biāo)測(cè)定 將肝組織塊固定，石蠟包埋、切片、HE染色后，在光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化，蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞GSTP和GGT蛋白的表達(dá)。制備肝勻漿，按照測(cè)試盒操作方法測(cè)定SOD、GPX、CAT、GST、MDA水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用Prism5.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，以單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1RUWE對(duì)各組血清GGT、AST和ALT活性的影響 模型組血清GGT、AST和ALT活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；與模型組比較，RUWE組血清GGT、AST和ALT活性顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2RUWE對(duì)各組肝臟抗氧化酶活性的影響 與對(duì)照組比較，模型組肝組織勻漿SOD、GPX、CAT活性均顯著降低(P<0.05)，GSTP活性和MDA含量顯著增高(P<0.05)。而RUWE顯著降低MDA水平(P<0.05)，提高SOD活性(P<0.05)。與模型組比較，RUWE組肝組織CAT和GPX活性有上升趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組血清GGT 、ALT和AST活性及肝勻漿SOD、GPX、CAT、GSTP及MDA檢測(cè)結(jié)果比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下圖同

2.3蛋白印跡法檢測(cè)RUWE對(duì)各組肝組織GGT和GSTP表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組肝組織GSTP和GGT蛋白表達(dá)增高(P<0.05)；與模型組比較，RUWE組肝組織GGT和GSTP蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，提示RUWE對(duì)肝臟癌前病變具有保護(hù)作用。見圖1。

圖1 蛋白印跡法檢測(cè)各組肝組織GGT和GSTP表達(dá)

2.4RUWE對(duì)大鼠癌前病變初期肝組織病理學(xué)的影響 對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好。模型組大鼠肝細(xì)胞失去正常排列，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，匯管區(qū)有以卵圓細(xì)胞為主的小細(xì)胞增生，肝細(xì)胞水腫明顯，脂肪變性廣泛，形成脂肪空泡。RUWE組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本存在，但肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞炎性病變減輕，可見較多點(diǎn)狀壞死或灶狀壞死，核異型性大。見圖2。

圖2 肝組織病理學(xué)改變(HE，×200)

3 討 論

肝癌前病變是指病理上易發(fā)生癌變的肝組織異常，是指從肝臟出現(xiàn)炎癥、肝細(xì)胞水腫、細(xì)胞結(jié)節(jié)到肝細(xì)胞纖維化的演進(jìn)過程，主要表現(xiàn)為肝組織非典型增生〔9，10〕。因此，本研究以肝癌前病變初期為切入點(diǎn)，以尋求延緩或阻滯肝細(xì)胞癌變進(jìn)程的可能途徑。本研究通過改良Solt-Farber法復(fù)制大鼠肝癌前病變模型，其誘發(fā)的肝癌前病變與人體肝癌發(fā)生過程較為相似〔9，10〕。GGT和GSTP是肝癌前病變的重要標(biāo)志之一〔9〕，RUWE可降低癌前病變大鼠肝組織GSTP和GGT蛋白的表達(dá)，降低血清GGT、ALT和AST活性，減輕肝細(xì)胞病變，提示RUWE對(duì)大鼠肝癌前病變具有抑制作用。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與自由基代謝有關(guān)。正常情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，抗氧化酶類與非酶抗氧化劑可組成一個(gè)防御系統(tǒng)，以清除體內(nèi)過多的自由基，不至于引起細(xì)胞內(nèi)過量脂質(zhì)過氧化而出現(xiàn)細(xì)胞損傷〔9，10〕。肝細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)體內(nèi)自由基代謝失衡，自由基產(chǎn)生增多，對(duì)蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等造成損傷〔9，10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明肝臟發(fā)生癌前病變后大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化水平升高，抗氧化能力下降，解毒酶活性增高，說明大鼠肝細(xì)胞存在一定氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符〔10〕。而RUWE可降低大鼠肝臟氧化應(yīng)激水平，這有助于延緩肝細(xì)胞癌變進(jìn)程。