徐永良 張大偉 趙毅玲 馮克儉 孫 平

(牡丹江醫(yī)學院解剖教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

直腸癌是發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌的消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，且近年來發(fā)病率逐年升高〔1,2〕。早期直腸癌以淋巴轉移為主〔3〕。淋巴管生成決定是否發(fā)生直腸癌淋巴道轉移，直腸癌細胞能夠通過局部淋巴管擴散到達遠處器官，進而對直腸癌患者的預后產(chǎn)生影響〔4〕。因而，通過檢測淋巴管的生成預測直腸癌患者的預后具有重要的臨床意義。黏著斑激酶(FAK)屬于非受體酪氨酸激酶成員之一，在轉導過程中發(fā)揮整合素介導信號的作用，F(xiàn)AK的活化與腫瘤細胞的侵襲和轉移有著密切關系〔5〕。血管內皮生長因子(VEGF)-C是由腫瘤細胞分泌的一種特異性的促淋巴管生成因子，通過與特異性受體結合誘導淋巴管的生成〔6〕。微淋巴管密度(LMVD)是顯示淋巴管數(shù)量預測腫瘤是否發(fā)生淋巴結轉移的重要參數(shù)之一。本研究通過免疫組化方法檢測直腸癌組織內FAK、VEGF-C和LMVD的表達，探討三種蛋白表達的聯(lián)合檢測評估對直腸癌淋巴管生成臨床判定的重要性。

1 資料與方法

1.1病例資料 選取2014年5月至2015年5月牡丹江醫(yī)學院紅旗醫(yī)院胃腸外科收治的直腸癌患者83例，男52 例,女31例，年齡33～76歲。其中高分化腺癌6例，中分化腺癌24例，低分化腺癌53例；漿膜受侵45例,未受侵38例； 52例有淋巴結轉移，31例無淋巴結轉移；Dukes分期:A、B、C、D期分別有12例，17例，36例，18例。對照組83例為直腸癌術后距腫瘤邊緣5～10 cm的正常組織。

1.2檢測各蛋白表達 FAK兔抗人多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司)；VEGF-C、D2-40鼠抗人單克隆抗體、羊抗鼠及羊抗兔二抗試劑盒、防脫載玻片、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(福州邁新生物技術公司)。所有標本甲醛固定、石蠟包埋、4 μm厚度連續(xù)切片，SP染色步驟按試劑盒說明書操作。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.3結果判斷 細胞質呈棕褐色為D2-40陽性表達，胞質內淺黃色至棕褐色染色時為VEGF-C和FAK 陽性表達。在3個不同的200倍光鏡視野下對切片進行分析，半定量計分法判定：①按細胞質染色程度評分：無著色且與背景顏色一致為0分；略高于背景顏色的淺黃色為1分；顯著高于背景顏色的棕黃色為2分；棕褐色為3分。②以陽性細胞所占比例為依據(jù)進行評分：陰性為0分；≤10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。③以陽性著色程度與陽性細胞所占比例的乘積為依據(jù)進行評分：(-)0～2 分，(+)3～4 分，()5～8 分，()9～12 分。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行t及χ2檢驗，相關性分析采用Spearman秩和檢驗。

2 結 果

2.1組織D2-40標記LMVD結果 直腸組織D2-40陽性染色微淋巴管形態(tài)大小不一，壁較薄，其 LMVD 為(3.9±2.5)；直腸癌組織中明確可見 D2-40 陽性染色微淋巴管，其 LMVD 為(8.3±2.1)，二者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2直腸癌組織中FAK和VEGF-C表達與臨床病理特征的關系 83例直腸癌中有55例(66.27%)VEGF-C 呈陽性表達，免疫反應物質表現(xiàn)為直腸癌細胞胞質內棕黃色顆粒染色，背景不著色；VEGF-C 蛋白的表達與直腸癌患者淋巴結轉移和 Dukes 分期顯著相關(P<0.01)。FAK 在83例直腸癌中有67例(77.91%)呈陽性表達。主要呈彌漫性或顆粒狀棕黃色位于直腸癌細胞胞質內。FAK 的表達與直腸癌的Dukes 分期和淋巴結轉移均密切相關(P<0.01)，而與腫瘤浸潤深度、分化程度、患者年齡、性別均無關(P>0.05)。見表1。

2.3直腸癌 LVMD與FAK、VEGF-C表達的相關性 83例直腸癌標本中,LVMD>8.13為高LVMD組。在直腸癌組織中高LMVD與 FAK和VEGF-C的表達均為正相關(P<0.05)，見表2。

表1 直腸癌VEGF-C和FAK的表達與臨床病理特征的關系(n)

與相應的亞組比較：1)P<0.01

表2 直腸癌LMVD與FAK、VEGF-C表達的相關性(n)

與低LMVD組比較：1)P<0.01

3 討 論

直腸癌轉移早期就會出現(xiàn)淋巴結轉移。由于直腸癌淋巴結轉移中淋巴管生成發(fā)揮巨大作用，逐漸獲得了越來越多的重視和了解。淋巴管的結構和形態(tài)與血管相似，二者常相伴生長，加大了區(qū)分的難度。因此，淋巴管管腔的識別及生物學特性的判定對研究腫瘤淋巴結轉移具有重要的意義。淋巴管內皮細胞培養(yǎng)技術隨著淋巴管內皮細胞分子標志物的發(fā)現(xiàn)而逐漸提高，腫瘤淋巴管生成作為獨立的研究領域，正逐漸成為關注的熱點〔3，7〕。FAK是一種對細胞外基質成分和腫瘤細胞的黏附、信號轉導均有一定的影響的蛋白質〔8，9〕。VEGF-C是一種能與VEGF受體(VEGFR)-3結合的特異性淋巴管內皮細胞調節(jié)因子，其具有介導和啟動受體的酪氨酸激酶信號系統(tǒng)，調節(jié)淋巴管生成的作用〔10〕。D2-40是目前公認的標記淋巴管管腔的特異性標記物，其顯示的LMVD常用來研究淋巴管生成在腫瘤淋巴結轉移中的作用。本研究結果顯示FAK和VEGF-C均高表達于直腸癌組織細胞質內。兩者的高表達均與直腸癌患者淋巴結轉移及Dukes 分期密切相關，并且FAK和VEGF-C的表達與LMVD表達也具有明顯的相關性，都提示聯(lián)合檢測FAK、VEGF-C和LMVD的表達對判斷直腸癌內淋巴管生成具有重要價值。這將有利于對直腸癌淋巴結轉移分析和患者的預后進行評估，為臨床尋找特異性靶點抑制直腸癌淋巴結轉移提供理論依據(jù)。