張春蘭， 方亭文， 趙明睿， 顧愛華

(南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 211166)

2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D)是具有代表性的合成植物生長(zhǎng)激素,已被確認(rèn)有環(huán)境內(nèi)分泌干擾作用。2,4-D是廣譜的除草劑,廣泛用于控制谷類作物、草坪、牧場(chǎng)、草原中闊葉雜草的生長(zhǎng)。其過量殘留會(huì)對(duì)蔬菜、人畜、環(huán)境產(chǎn)生威脅,在美國(guó)、意大利、以色列、西班牙、荷蘭和中國(guó)等國(guó)家仍在噴灑2,4-D進(jìn)行柑橘果實(shí)保鮮[6-7]，美國(guó)環(huán)保署農(nóng)藥2,4-D參考劑量為0.21mg/(kg·d),相應(yīng)的人體生物等效劑量成人為10.5mg/L、兒童為7mg/L。目前有關(guān)2,4-D的毒性作用主要集中在神經(jīng)毒性、生殖發(fā)育毒性等方面，對(duì)其血液毒性作用機(jī)制尚不清楚。斑馬魚已經(jīng)被證實(shí)是有效檢測(cè)環(huán)境有毒物質(zhì)的脊椎模式動(dòng)物，82%的斑馬魚基因與人類同源，而且斑馬魚生命早期發(fā)育和疾病發(fā)生過程與人類相似，斑馬魚造血相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與人類的造血過程高度同源。因此，斑馬魚模型是研究心血管系統(tǒng)發(fā)育的良好模型，尤其適用于研究外源性化合物暴露對(duì)血液系統(tǒng)發(fā)育的影響。因此，本次研究利用斑馬魚模型研究2,4-D暴露后對(duì)造血干細(xì)胞發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 2，4-D溶解

2,4-D購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度>97%，相對(duì)分子質(zhì)量為221.04。稱量5mg的2,4-D粉末，溶于50mL的去離子水中，制備100mg/L的母液，常溫磁力攪拌12h，形成穩(wěn)定的水溶液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 斑馬魚受精卵的收集和培養(yǎng)

斑馬魚是一種性情溫和、雜食性的熱帶淡水魚，胚胎透明便于觀察。水質(zhì)要求： pH 7～8，水溫28.5℃，溶解氧5.0mg/L以上。選取適量的雌魚和雄魚，按照1∶1的比例配對(duì)置于插有隔板的魚缸內(nèi)，次日清晨拔板收集受精卵；將受精卵置于48孔板中，每孔1個(gè)，每孔滴加不同濃度2,4-D，使2,4-D終濃度分別控制在0、5、10、20mg/L共4個(gè)濃度，每個(gè)濃度組12個(gè)復(fù)孔；置于28.5℃孵箱中孵化，24h為周期循環(huán)換液，培養(yǎng)并觀察至斑馬魚出生后72h。

本研究所用斑馬魚品系包括野生型Tubingen品系和cmyb： eGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚系(源自哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院)。

1.3 斑馬魚胚胎的急性毒性實(shí)驗(yàn)

野生型斑馬魚胚胎暴露于0、5、10、20mg/L的2,4-D水溶液，各組12個(gè)斑馬魚胚胎，于受精后72h(72hpf)記錄死亡與形體畸形數(shù)目并拍照記錄。cmyb： eGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎暴露于2,4-D水溶液中，在胚胎48hpf用共聚焦顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司LSM510型)拍攝熒光標(biāo)記的造血干細(xì)胞。

1.4 血細(xì)胞基因表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

收集48hpf各濃度組胚胎至無RNA酶的EP管中，利用TRIzol法抽提總RNA，再用美國(guó)Invitrogen公司SuperScriptTMⅣ反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,采用造血干細(xì)胞(cmyb)、紅系(gata1)和粒-單核系細(xì)胞(l-plastin、pu.1)標(biāo)記基因引物(引物序列見表1)，進(jìn)行熒光核染料SYBR Green的定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為： 95℃ 2min；95℃ 15s；60℃ 30s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15s；60℃ 15s；95℃ 15s。因此，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組胚胎的造血干細(xì)胞(cmyb)、紅系(gata1)和粒-單核系細(xì)胞(l-plastin、pu.1)的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

造血干細(xì)胞: cmyb；紅系: gata1；粒-單核系細(xì)胞: l-plastin、pu.1

1.5 造血干細(xì)胞的cmyb探針原位雜交

收集特定時(shí)相各濃度組斑馬魚胚胎，除去卵膜，4%多聚甲醛于4℃搖床上固定24h。100%含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)清洗后，雙氧水去除色素。4%多聚甲醛置于室溫下再次固定2～3h。100%PBST清洗后，25%、50%、75%PBST/甲醇溶液梯度脫水，-20℃冰箱保存。75%、50%、25%PBST/甲醇溶液梯度水化-20℃保存的胚胎。隨后100%PBST溶液再次清洗。蛋白酶K消化。4%多聚甲醛置于室溫下再次固定1h以上。100%PBST溶液清洗數(shù)次。用HYB(-)和HYB(+)預(yù)雜交溶液于70℃雜交爐中進(jìn)行預(yù)雜交，然后加入0.1～1mg/L的Cmyb探針，于70℃雜交爐中過夜。洗滌后加入地高辛抗體，4℃過夜進(jìn)行封閉和抗體孵育。再次洗滌后，用顯色試劑NBT/BCIP堿性磷酸酶底物(美國(guó)VECTOR Laboratories公司)顯色，在顯微鏡下觀察并記錄對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組胚胎中cmyb探針標(biāo)記的藍(lán)色點(diǎn)的變化情況，來反映cmyb表達(dá)量的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 野生型斑馬魚胚胎急性毒性反應(yīng)

野生型斑馬魚胚胎暴露于0、5、10、20mg/L的2,4-D水溶液中，在72hpf時(shí)，胚胎LC50為16.3mg/L，95%的可信區(qū)間為13.2～21.3mg/L，見圖1A。隨著2,4-D的濃度增加，各濃度組的胚胎孵化率降低，在72hpf時(shí)5、10mg/L的2,4-D濃度組胚胎孵化率為91.7%，見圖1B。5、10mg/L的2,4-D濃度組胚胎形態(tài)發(fā)育正常，而20mg/L的2,4-D濃度組胚胎出現(xiàn)明顯的形態(tài)畸形，表現(xiàn)為小頭、心包水腫、脊柱彎曲、卵黃囊畸形，見圖2。

2.2 Cmyb： eGFP轉(zhuǎn)基因魚系熒光觀察和原位雜交

用Cmyb探針標(biāo)記造血干細(xì)胞，在30、48和72hpf，用10mg/L 2,4-D水溶液處理后，斑馬魚胚胎造血干細(xì)胞數(shù)量少于空白對(duì)照組，見圖3。斑馬魚造血最早始于中間細(xì)胞群(intermediate cell mass, ICM)區(qū)，在30hpf 時(shí)10mg/L 2,4-D濃度組胚胎的ICM區(qū)域藍(lán)色點(diǎn)少于對(duì)照組，見圖3A～B。48hpf時(shí)10mg/L 2,4-D濃度組中cmyb探針標(biāo)記的藍(lán)色點(diǎn)明顯少于對(duì)照組，見圖3C～D，同時(shí)，在48hpf cmyb： eGFP轉(zhuǎn)基因胚胎的激光共聚焦結(jié)果表明10mg/L 2,4-D濃度組胚胎的尾部區(qū)域藍(lán)色熒光標(biāo)記的造血干細(xì)胞數(shù)量亦少于對(duì)照組(t=13.11，P<0.001)，見圖3E～F。72hpf 整胚cmyb探針原位雜交實(shí)驗(yàn)中，10mg/L 2,4-D濃度組在尾部造血組織(caudal hematopoietic tissue, CHT)區(qū)域幾乎未見藍(lán)色點(diǎn)(圖3G～H),同樣72hpf cmyb： eGFP轉(zhuǎn)基因胚胎的激光共聚焦中，10mg/L 2,4-D濃度組紅色熒光標(biāo)記的造血干細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組(t=7.176，P<0.001)，見圖3I～J。

圖1 不同濃度2，4-D組斑馬魚胚胎不同時(shí)間的死亡率與孵化率Fig.1 Mortality and hatching rate of zebrafish embryos at different time in groups with different concentrations of 2,4-DA: 死亡率；B: 孵化率

圖2 不同濃度2，4-D組斑馬魚胚胎72bpf時(shí)發(fā)育情況Fig.2 The development of zebrafish embryos with different concentrations of 2,4-D at 72hpf

2.3 基因表達(dá)分析

斑馬魚胚胎暴露于10mg/L 2,4-D水溶液48hpf 后，相比于對(duì)照組，造血干細(xì)胞標(biāo)記基因cmyb(t=28.98，P<0.001)和原始紅系祖細(xì)胞標(biāo)記性基因gata1(t=7.176，P<0.001)表達(dá)量明顯降低(P<0.001)，粒一單核系細(xì)胞分化標(biāo)記基因l-plastin(t=0.02，P=0.98)和pu.1(t=0.03，P=0.98)表達(dá)量并無明顯改變，見表2。說明10mg/L 2,4-D水溶液暴露后對(duì)斑馬魚胚胎的造血干細(xì)胞標(biāo)記基因cmyb和原始紅系祖細(xì)胞標(biāo)記基因gata1表達(dá)影響較大。

圖3 10mg/L 2,4-D對(duì)斑馬魚胚胎干細(xì)胞分化的影響Fig.3 Effect of 10mg/L 2,4-D on hematopoietic stem cell differentiation in zebrafish embryos

組別pu.1cmybgata1l-plastin對(duì)照組0.411.218.531.0010mg/L 2,4-D組0.412.982.861.01t0.0328.9813.600.02P0.98<0.001<0.0010.98

3 討 論

2,4-二氯苯氧乙酸(亦稱2,4-D)已經(jīng)使用超過60年，在進(jìn)入市場(chǎng)銷售的產(chǎn)品中超過600件商品檢出2,4-D的殘留，人類和生物體通過多種途徑暴露于2,4-D。因此，2,4-D是一種潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)因子，本研究利用良好的造血發(fā)育模型斑馬魚，觀察急性毒性反應(yīng)，檢測(cè)血細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量變化和造血干細(xì)胞發(fā)育情況，以揭示2,4-D暴露后潛在的造血干細(xì)胞發(fā)育毒性及其機(jī)制。

造血干細(xì)胞是指具有自我更新能力并能分化為血細(xì)胞前體細(xì)胞，最終發(fā)育為成熟的血細(xì)胞，包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板。其自我更新和分化受到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的共同嚴(yán)密調(diào)控，任何自我更新和分化的調(diào)控異常都可能導(dǎo)致血液疾病發(fā)生[10]。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)抑制cmyb基因表達(dá)導(dǎo)致斑馬魚胚胎和成魚造血干細(xì)胞遷移受阻，Mucenski等[12]敲除小鼠的cmyb基因，出現(xiàn)造血干細(xì)胞遷移和分化障礙，說明cmyb基因是造血干細(xì)胞維持正常功能的重要基因。Kubrak等[13]發(fā)現(xiàn)金魚胚胎暴露于2,4-D水溶液后出現(xiàn)淋巴細(xì)胞數(shù)量減少。綜合前人的研究成果，本研究假設(shè)2,4-D可能影響cmyb基因的表達(dá)導(dǎo)致造血干細(xì)胞發(fā)育毒性，并利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)造血發(fā)育基因表達(dá)，原位雜交觀測(cè)cmyb基因的表達(dá)，然后在cmyb： eGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎中進(jìn)一步研究造血干細(xì)胞的發(fā)育情況。

本研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎暴露于2,4-D水溶液中，出現(xiàn)造血干細(xì)胞毒性，表現(xiàn)為2,4-D暴露組cmyb基因表達(dá)量降低，同時(shí)cmyb熒光標(biāo)記的造血干細(xì)胞數(shù)量減少。因此，斑馬魚胚胎暴露于2,4-D可能通過影響cmyb基因的表達(dá)導(dǎo)致造血干細(xì)胞發(fā)育毒性。但是，在本次研究中未能在cmyb基因蛋白水平和功能水平上，進(jìn)一步闡述cmyb基因介導(dǎo)的2,4-D造血干細(xì)胞發(fā)育毒性。在未來的研究中，我們將著重于這兩部分的研究，以期進(jìn)一步了解2,4-D造血毒性的具體機(jī)制。