王強(qiáng)兄， 張莉莉， 姜 淼， 趙敬軍

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院皮膚與性病科，上海 200065)

近年來(lái)，侵襲性真菌感染的發(fā)病率和死亡率增加，其中以念珠菌感染最常見[2]。念珠菌感染中白念珠菌占90%以上，然而隨著廣譜抗真菌藥物的廣泛使用，非白念珠菌發(fā)病率也逐漸上升[3]。研究表明，持續(xù)感染的真菌病灶中大多存在生物膜，生物膜是微生物群落為了自我保護(hù)而產(chǎn)生的黏附在非生物或生物材料表面的細(xì)胞外聚合物基質(zhì)(ECM)包裹菌細(xì)胞群落的一種形態(tài)。念珠菌生物膜形成后，感染菌株的侵襲力和耐藥性增加。兩性霉素B(amphotericin B, AMB)為一種廣譜殺真菌藥物，臨床使用較廣，常用以治療復(fù)雜真菌感染。而該藥因腎毒性較大限制了其在臨床上的應(yīng)用。研究表明，人參莖葉皂苷(Ginseng stem-leaf saponins,GSLS)具有一定的抗真菌作用，與氟康唑聯(lián)合使用時(shí)可以增加其對(duì)念珠菌的抗菌活性。本研究將人參莖葉皂苷與兩性霉素B聯(lián)合應(yīng)用于念珠菌生物膜，觀察二者是否具有協(xié)同作用，為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源

白念珠菌90028由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院真菌室饋贈(zèng)；白念珠菌SC5134、ATCC22086由同濟(jì)大學(xué)姜遠(yuǎn)英教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；近平滑念珠菌ATCC22019由同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院皮膚科真菌室提供。臨床分離株： 15株由海軍醫(yī)科大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；13株由同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科及真菌室提供；3株由寧波市鄞州區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。它們分別來(lái)自血液、腦脊液、腹腔引流液等體液。

1.2 抗真菌藥物和試劑

兩性霉素B購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；人參莖葉皂苷購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；二甲基亞砜(DMSO)、甲基四氮鹽(XTT)、VitK3、1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；PBS購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；結(jié)晶紫粉末購(gòu)自Biosharp公司。

1.3 菌株鑒定

將分離純化的菌株接種于SDA培養(yǎng)基，按照之前的方法對(duì)所有菌株提取DNA并進(jìn)行ITS基因擴(kuò)增測(cè)序及β-tubulin基因擴(kuò)增測(cè)序，對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。

1.4 生物膜的制備

將分離純化的菌株接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)18～36h，采集對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。用YPD培養(yǎng)液調(diào)整密度至1×107/mL，除第1列(陰性對(duì)照)，96孔培養(yǎng)板各孔均加入100μL標(biāo)準(zhǔn)菌液，37℃孵育90min。棄懸浮液，PBS緩沖溶液(pH7.2)清洗3遍。去懸浮細(xì)胞，加入200μL的1640培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)48h。棄懸浮液，PBS(pH7.2)沖洗3次(動(dòng)作輕柔，切勿破壞生物膜)。

1.5 體外藥敏及生物膜活力測(cè)定[8-9]

參照M38-A2方案，用二甲亞砜將兩性霉素B及人參莖葉皂苷粉末分別配置成濃度為1600μg/mL及5120μg/mL母液(-80℃遮光保存)。隨后用1640培養(yǎng)液將兩性霉素B母液倍比稀釋成0.25～128μg/mL 10個(gè)濃度梯度，人參莖葉皂苷倍比稀釋成0.5～256μg/mL。甲基四氮鹽用PBS配制成濃度為0.5mg/mL溶液，VitK3用100%丙酮配制成濃度為10mmol/L溶液，過濾除菌后分裝保存在-70℃。采用棋盤稀釋法(8×12)進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。第1列(陰性對(duì)照)僅加入1640培養(yǎng)液。2～11列按照濃度由高到低依次加入100μl的AMB溶液，96孔板A～G行按濃度由高到低依次加入100μL GSLS。第12列僅加入GSLS，第H行僅加入AMB的作為單藥對(duì)照。置37℃培養(yǎng)箱48h。棄懸浮液，PBS輕柔(pH7.2)清洗3次后每孔加入100μL XTT/VitK3溶液，以XTT法測(cè)定生物膜活性。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 AMB與GSLS作用形式評(píng)價(jià)

用部分抑制濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index, FICI)評(píng)價(jià)AMB與GSLS的作用形式。FICI的計(jì)算方法為： FICI=(MICAMB聯(lián)用/MICAMB單用)+(MICGSLS聯(lián)用/MICGSLS單用)。其中，F(xiàn)ICI≥4表現(xiàn)為拮抗作用，1≤FICI<4表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用，0.5

1.7 結(jié)晶紫分光光度法測(cè)定生物膜量[10]

將96孔板培養(yǎng)好的生物膜置室溫2h后每孔加入150μL 99%的甲醇固定，室溫作用20min后棄甲醇，過夜干燥。向各孔中加入150μL 0.5%結(jié)晶紫溶液，室溫作用15min后以雙蒸水清洗止無(wú)色素洗脫為止。每孔加入100μL 95%乙醇洗脫生物膜中的結(jié)晶紫，室溫靜置約30min后取各孔75μL有色上清液置于新的96孔板中，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)測(cè)定570nm波長(zhǎng)的吸光度(A570)。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，醫(yī)院分離株對(duì)藥物的敏感性差異比較采用Kruslal-Wallis秩和檢驗(yàn)法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 菌種的鑒定結(jié)果

31株念珠菌中，其中白念珠菌16株、近平滑念珠菌6株、熱帶念珠菌8株，季也蒙念珠菌1株。

2.2 兩性霉素B聯(lián)合人參莖葉皂苷抗念珠菌生物膜藥敏結(jié)果

對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)菌株，藥物單用時(shí)，可觀察到AMB具有強(qiáng)耐藥性，(sessile minimal inhibition concentration, sMIC90)為8～64μg/mL；GSLS的sMIC90>256μg/mL；兩藥聯(lián)用時(shí)，AMB和GSLS對(duì)受試菌株的sMIC90分別減少了3/4～15/16和7/8，見表1。

表1 AMB聯(lián)合GSLS體外抗白念珠菌、近平滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株生物膜藥敏結(jié)果

sMIC為菌株處于生物膜狀態(tài)下的最低抑菌濃度

16株臨床白念珠菌藥敏。結(jié)果顯示，藥物單用時(shí)，AMB和GSLS的sMIC90分別為16～128μg/mL、>256μg/mL；兩藥聯(lián)用時(shí)，AMB和GSLS對(duì)受試菌株的sMIC90分別減少了3/4～15/16和7/8。FICI指數(shù)顯示，在所有的菌株聯(lián)合用藥顯示出協(xié)同抗真菌作用，見表2。

表2 AMB聯(lián)合GSLS體外抗臨床白念珠菌生物膜藥敏結(jié)果

臨床分離株近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、季也蒙念珠菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)藥物單用時(shí)，AMB和GSLS的48h的sMIC90分別為16～128μg/mL、>256μg/mL；當(dāng)兩藥聯(lián)用時(shí)，AMB和GSLS的48h sMIC90分別減少了3/4～31/32和7/8。所用菌株FICI值均≤0.5，顯示出協(xié)同抗真菌作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3、4。

表3 AMB聯(lián)合GSLS體外抗近平滑念珠菌生物膜藥敏結(jié)果

表4 AMB聯(lián)合GSLS體外抗熱帶念珠菌生物膜藥敏結(jié)果

2.3 結(jié)晶紫定量生物膜的量

上述的XTT法只能檢測(cè)有活性的細(xì)胞，而結(jié)晶紫法可以檢測(cè)活細(xì)胞、死細(xì)胞及生物膜中細(xì)胞外基質(zhì)。與單獨(dú)運(yùn)用AMB和GSLS相比，將AMB與GSLS聯(lián)合作用于白念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、季也蒙念珠菌4種菌株時(shí)，生物膜的生成量均明顯減少(P<0.05)，與XTT減低法測(cè)定的結(jié)果相同，見表5。

表5 結(jié)晶紫染色減低法測(cè)定生物膜結(jié)果

3 討 論

真菌感染，特別是侵襲性真菌感染的發(fā)病率、致死率呈逐年上升的趨勢(shì)，以白念珠菌為代表的念珠菌感染率與病死率逐年增長(zhǎng)。在念珠菌致病過程中，生物膜的形成發(fā)揮了重要的作用。念珠菌生物膜形成后，感染菌株的侵襲力和耐藥性增加。研究表明，在體外，生物膜幾乎對(duì)目前所有已知的抗真菌藥物均顯示出明顯的耐藥性。

本實(shí)驗(yàn)采用FICI評(píng)價(jià)AMB與GSLS的作用形式，用XTT法直觀反映活菌數(shù)的百分比，XTT在有甲萘醒(電子轉(zhuǎn)移劑)存在時(shí)，在活細(xì)胞內(nèi)被還原成可溶性的棕色產(chǎn)物，用酶標(biāo)儀測(cè)定溶液值，來(lái)判斷細(xì)胞的生長(zhǎng)活性[11]。用XTT法測(cè)試結(jié)果顯示，AMB單用時(shí)不能顯著抑制白念珠菌生物膜中菌株的生長(zhǎng)，而加入GSLS時(shí)，所有試驗(yàn)菌株的FICI值均在0.5以下，也就是都體現(xiàn)出協(xié)同作用。說明AMB單用時(shí)不能顯著抑制白念珠菌生物膜中菌株的生長(zhǎng)，而加入GSLS時(shí)，AMB的抗真菌作用顯著增強(qiáng)，表明GSLS能增強(qiáng)其體外抗生物膜活性。雖然在過去的幾十年中，白念珠菌在院內(nèi)真菌感染中是最主要的致病真菌，但非白念珠菌感染的病例也在不斷上升[12]。本研究應(yīng)用同樣的方法評(píng)估了AMB和GSLS對(duì)近平滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株及臨床株、熱帶念珠菌臨床分離株、季也蒙念珠菌臨床分離株生物膜的聯(lián)合作用效果，結(jié)果顯示均具有協(xié)同抑制作用。

用結(jié)晶紫定量法(CV)對(duì)念珠菌生物膜進(jìn)行測(cè)定試驗(yàn)中，盡管CV法不能夠很好的區(qū)分生物膜中的死細(xì)胞、活細(xì)胞和生物膜基質(zhì)，但是它能夠較好地測(cè)定生物膜生成量在藥物作用下的變化。本研究發(fā)現(xiàn)GSLS聯(lián)合AMB與GSLS、AMB單用相比，能明顯減少念珠菌生物膜的產(chǎn)生(P<0.5)。AMB聯(lián)合GSLS能夠明顯增加成熟念珠菌生物膜藥物的敏感性。

本研究通過XTT減低法和CV法對(duì)念珠菌生物膜在抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)中的結(jié)果基本一致，研究結(jié)果顯示： GSLS與AMB聯(lián)用對(duì)白念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、季也蒙念珠菌生物膜均具有較強(qiáng)的協(xié)同抑制作用。盡管目前GSLS的藥理作用還未得到證實(shí)，但是研究人員認(rèn)為GSLS可能是通過結(jié)合真菌細(xì)胞膜的甾醇類而使真菌細(xì)胞破裂，從而達(dá)到殺菌的效果；當(dāng)兩藥聯(lián)用時(shí)，GSLS可能是非特異性地改變生物膜中細(xì)胞外基質(zhì)成分和破壞生物膜的完整性，使得AMB容易到達(dá)真菌細(xì)胞內(nèi)，從而加強(qiáng)AMB的殺菌作用，因此兩者出現(xiàn)較強(qiáng)的協(xié)同作用。研究表明，生物膜形成是真菌感染引起的許多疾病的發(fā)病機(jī)制，也使疾病進(jìn)展變得越來(lái)越復(fù)雜[15]。隨著對(duì)真菌生物膜的形成機(jī)制和耐藥機(jī)制研究的深入，以及單一藥物效果有限、副作用嚴(yán)重、對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性這些都限制了單一抗真菌藥物的使用，因此，需要研究者不斷發(fā)現(xiàn)新的抗真菌藥物和治療方案。本研究發(fā)現(xiàn)GSLS能夠顯著增強(qiáng)AMB抗念珠菌生物膜的作用，為體外或者原位生物膜依賴性的真菌感染，特別是為深部真菌感染的防治帶來(lái)了希望，但有關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。