羅 輝， 孔 瑞， 王 楠， 盧 潔

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200072)

肝纖維化是常見(jiàn)的慢性可逆性肝病，是肝硬化甚至原發(fā)性肝癌進(jìn)展前期階段。目前已有研究表明，肝纖維化過(guò)程存在多項(xiàng)病理改變，包括匯管區(qū)放射狀排列結(jié)構(gòu)改變，隔板形成；小葉中心靜脈壁增厚及肝竇周纖維化；門(mén)管區(qū)炎癥、碎片狀壞死及脂肪變等。除此之外，已證實(shí)多種類(lèi)型細(xì)胞激活包括肝星狀細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等參與細(xì)胞外基質(zhì)形成及膠原沉積；多個(gè)細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β及氧化應(yīng)激產(chǎn)物等也參與肝纖維化過(guò)程。有研究表明，Notch信號(hào)通路協(xié)同TGF-β1/smads信號(hào)通路“cross talk”作用與肝纖維化過(guò)程中肝星狀細(xì)胞激活及免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

橘皮素是從果實(shí)橘皮中提取得到的天然產(chǎn)物，目前研究表明該藥作為Notch通路抑制劑具有保護(hù)神經(jīng)、防治腎衰、抑制氧化應(yīng)激，拮抗炎癥反應(yīng)等作用。Yuan等證明，在大鼠慢性肝病模型中，同時(shí)服用橘皮素可以增強(qiáng)水飛薊素生物活性發(fā)揮抗炎保肝作用。本研究應(yīng)用膽總管結(jié)扎術(shù)創(chuàng)建膽汁淤積性肝纖維化小鼠模型，探討橘皮素通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路對(duì)治療肝纖維的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

橘皮素(化合物純度達(dá)99.7%)購(gòu)自Target Molecule公司，天狼猩紅染色試劑盒購(gòu)自Abcam公司，Masson染色試劑盒購(gòu)自杰美生物公司，小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司，透明質(zhì)酸(HA)和層粘連蛋白(LN)ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Cusabio公司，羥脯氨酸(Hyp)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成公司，全細(xì)胞及組織蛋白提取試劑盒購(gòu)自蘇州新賽美生物公司，Tris堿、SDS、甘氨酸、甲醇、硝酸纖維素膜(NC膜)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)及二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定凝膠試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，TRIzol、二乙基焦碳酸酯(DEPC)水、氯仿、異丙醇、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，兔抗鼠RBPJ一抗、兔抗鼠Hes1一抗、兔抗鼠Notch1一抗、兔抗鼠TGF-β1一抗，兔抗鼠smad2一抗、兔抗鼠smad3一抗(Cell Signaling Technology公司)，兔抗鼠Hey1一抗(Proteintech公司)。

1.2 動(dòng)物模型建立

將45只體質(zhì)量22～25g的8周齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為4組： 假手術(shù)組(10只)、膽總管結(jié)扎手術(shù)(BDL)組(15只)、橘皮素治療組(10只)及單純橘皮素用藥組(10只)。小鼠行BDL術(shù)前禁食24h，用0.1mL的1%戊巴比妥腹腔注射麻醉后行開(kāi)腹操作，臺(tái)式動(dòng)物手術(shù)顯微鏡下尋找小鼠膽總管，用8-0絲線結(jié)扎2次，于兩結(jié)扎點(diǎn)之間剪斷膽總管防止再通；手術(shù)過(guò)程中可向腹腔中滴注適量含抗生素的生理鹽水，結(jié)扎后逐層關(guān)腹，術(shù)后注意保暖及觀察小鼠狀態(tài)。假手術(shù)組術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉同BDL模型組及橘皮素治療組，開(kāi)腹后直接關(guān)腹，無(wú)需結(jié)扎膽總管。橘皮素治療組建模10d后開(kāi)始以100mg/kg橘皮素灌胃治療，每天1次，共20d。單純橘皮素用藥組無(wú)需手術(shù)，與橘皮素治療組同時(shí)進(jìn)行同劑量橘皮素灌胃。各組小鼠模型建立30d后采血處死，留取肝組織進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)藥物應(yīng)用劑量參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠肝臟H-E染色、Msaaon染色、天狼星紅染色 剪取小鼠新鮮肝臟組織約1cm×1cm×0.3cm大小，4%多聚甲醛固定過(guò)夜后依次浸入梯度濃度酒精脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，切片約4μm厚；石蠟烤片60℃ 2h，二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水后應(yīng)用H-E染料進(jìn)行常規(guī)染色；光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，由2位病理科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行病理學(xué)分析,觀察鏡下視野中小鼠肝臟組織炎癥與纖維化程度，纖維化評(píng)估采用Ishak評(píng)分中纖維化評(píng)分；每只小鼠肝組織非連續(xù)切片至少3張，每張H-E切片至少觀測(cè)5個(gè)鏡下視野進(jìn)行肝纖維化程度評(píng)估計(jì)分，取其均值。

石蠟切片常規(guī)處理后進(jìn)行Masson染色或天狼星紅染色，光鏡下觀察拍照，對(duì)膠原沉積陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域用Image J軟件進(jìn)行計(jì)算，每張切片至少觀察5個(gè)視野并用軟件計(jì)算得出陽(yáng)性染色面積所占總?cè)旧M織面積的百分比。

1.3.2 小鼠血清肝功能指標(biāo)ALT、AST及肝纖維化指標(biāo)LN、HA檢測(cè) 0.1mL 1%戊巴比妥麻醉小鼠后摘取眼球取血，4℃冰箱放置2h，3000r/min，離心半徑12cm，離心10min，將血清吸取至新1.5mL離心管中。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行常規(guī)包被封閉，加樣、抗體結(jié)合，加酶結(jié)合物，結(jié)果測(cè)定及繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ALT、AST、LN、HA樣本濃度。

1.3.3 小鼠肝臟組織Hyp含量測(cè)定 稱(chēng)取6～12mg新鮮小鼠肝臟組織制成勻漿，調(diào)節(jié)pH至中性，取上清，按照說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)液進(jìn)行操作，3500r/min離心10min后取上清樣本于酶標(biāo)儀550nm檢測(cè)吸光度值，計(jì)算組織中Hyp含量。

1.3.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝組織中相應(yīng)基因蛋白表達(dá)情況 石蠟切片60℃烤片2h，二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水后抗原修復(fù)，一抗染色過(guò)夜后二抗孵育，DAB顯色后中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察拍照，對(duì)棕色染色區(qū)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.5 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR) 剪取適量小鼠新鮮肝組織，使用組織研磨棒研磨均勻后應(yīng)用TRIzol提取組織RNA，RNA有效濃度稀釋至500ng/mL，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后用于熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)ΔΔCt值對(duì)Notch信號(hào)通路上關(guān)鍵基因表達(dá)量變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本實(shí)驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1。

1.3.6 Western印跡法 使用組織裂解液及磷酸酶和蛋白酶抑制劑混合液提取新鮮肝組織蛋白(按說(shuō)明書(shū)比例配制1∶100)，BCA法蛋白定量后上樣，電泳跑膠分離蛋白；使用NC膜轉(zhuǎn)膜后牛奶封閉至少1h，相應(yīng)條帶各自4℃孵育一抗過(guò)夜，濃度分別為Notch1(1∶500)、RBPJ(1∶1000)、Hes1(1∶1000)、Hey1(1∶500)、β-actin(1∶1000)，經(jīng)洗膜液清洗后，室溫孵育二抗1h，經(jīng)Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量。

表1 各基因檢測(cè)引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 肝臟大體形態(tài)及病理學(xué)評(píng)分

造模30d后，與假手術(shù)組相比，BDL模型組小鼠面部、頸部等處皮膚明顯黃染，肝臟肉眼可見(jiàn)分布均勻小結(jié)節(jié)，膽囊明顯增大；說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)造模成功，見(jiàn)圖1。H-E染色發(fā)現(xiàn)，BDL模型組小鼠鏡下可見(jiàn)肝小葉排列紊亂，肝板內(nèi)肝細(xì)胞氣球樣變性及出現(xiàn)嗜酸性星狀肝細(xì)胞，小葉中心靜脈壁增厚及肝竇周纖維化；多處小膽管增生，膽管上皮有淋巴細(xì)胞出現(xiàn)；淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及淋巴濾泡增生。橘皮素治療組纖維化程度較輕，可見(jiàn)匯管區(qū)腫大但少見(jiàn)隔板形成，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及濾泡增生較少見(jiàn)，門(mén)管區(qū)炎癥較輕，纖維化評(píng)分低于BDL模型組(P<0.05)。假手術(shù)組及橘皮素單純用藥組病理形態(tài)無(wú)明顯改變。

圖1 膽汁淤積性肝纖維化小鼠大體圖及離體肝臟Fig.1 The liver tissues from mice modelA： 左為BDL模型小鼠，右為假手術(shù)組小鼠；B： 正常小鼠肝臟；C： BDL模型小鼠肝臟，膽囊中膽汁已釋放

2.2 小鼠組織Masson染色及天狼星紅染色

Masson染色可見(jiàn)橘皮素治療組較BDL模型組膠原沉積明顯減少，膠原纖維陽(yáng)性染色為深藍(lán)色。Image J結(jié)果顯示橘皮素治療組藍(lán)染面積占比為21.04%±4.89%，BDL模型組為42.43%±7.03%(t=7.50,P<0.05)；天狼猩紅染色可見(jiàn)Ⅰ型膠原纖維沉積，實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果為紅色，見(jiàn)圖2，橘皮素治療組Ⅰ型膠原沉積占比為7.78%±0.49%，BDL模型組為2.94%±0.15%(t=28.44,P<0.05)。

2.3 小鼠血清ALT、AST、HA、LN結(jié)果

橘皮素藥物治療組血清ALT、AST、HA、LN水平均顯著低于BDL模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體數(shù)據(jù)分析見(jiàn)表2。

圖2 各組小鼠肝組織病理評(píng)估Fig.2 The effect of tangeretin on liver pathological changesA： 蘇木精伊紅染色，顯示橘皮素應(yīng)用后肝臟假小葉形成減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；B： Masson染色，橘皮素應(yīng)用可減少膠原纖維沉積，即藍(lán)色著色面積減少；C： 天狼星紅染色，橘皮素應(yīng)用可減少膠原纖維沉積，即橘紅色著色面積減少

2.4 小鼠組織Hyp含量測(cè)定

同BDL模型組相比，橘皮素治療組Hyp含量明顯降低，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(184±42) μg/g比(113±16) μg/g，t=4.72，P<0.05]。

表2各組小鼠血清ALT、AST、HA、LN水平比較

組別nALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)HA/(μg·L-1)LN/(ng·mL-1)假手術(shù)組1025.58±3.0834.82±2.06343.62±4.071.97±0.31BDL模型組151219.00±47.89?967.50±27.71262.80±38.1539.29±5.15橘皮素治療組1062.46±8.91?#231.70±72.6768.11±8.556.62±0.86橘皮素單純用藥組1027.56±3.1141.50±3.38948.97±5.702.21±0.42F241.9570.128.0447.02

HA: Hyaluronic acid透明質(zhì)酸；LN: Laminin層粘連蛋白；ALT: Alanine aminotransferase谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST: Aspartate aminotransferase谷草轉(zhuǎn)氨酶；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與BDL模型組比較，#P<0.05

2.5 Notch信號(hào)通路各組分表達(dá)量變化測(cè)定

與BDL模型組相比，橘皮素治療組Notch1、RBPJ、Hes1及Hey1蛋白表達(dá)量均明顯降低，見(jiàn)圖3。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與蛋白質(zhì)印跡結(jié)果一致，兩組Notch1、RBPJ、Hes1及Hey1基因表達(dá)水平差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.41、6.14、1.70、3.42，均P<0.05)，見(jiàn)表3。

小鼠組織石蠟包埋后切片，烤片后分別應(yīng)用Notch1, RBPJ, Hes1及Hey1一抗染色，顯微鏡下觀察陽(yáng)性著色率，與BDL模型組比較，橘皮素治療組陽(yáng)性著色率明顯降低，見(jiàn)圖4。

圖3 各組小鼠肝組織中Notch信號(hào)通路組分蛋白表達(dá)量Fig.3 The protein level of Notch signal in liver tissuesWestern印跡法分析各組小鼠肝組織中Notch信號(hào)通路表達(dá)量，通路中關(guān)鍵基因Notch1, RBPJ, Hes1, Hey1 表達(dá)量明顯被橘皮素抑制

圖4 小鼠肝組織Notch1, RBPJ, Hes1, Hey1表達(dá)免疫組化圖Fig.4 Effect of tangeretin on the Notch signalpathway in liver fibrosis應(yīng)用橘皮素治療后肝組織Notch1, RBPJ, Hes1, Hey1棕色陽(yáng)性細(xì)胞染色區(qū)域較BDL組明顯減少(×200)

2.6 橘皮素通過(guò)TGF-β1/smads信號(hào)通路對(duì)肝纖維化的調(diào)節(jié)作用

免疫組化結(jié)果顯示，與BDL模型組比較，橘皮素治療組小鼠肝組織TGF-β1、smad2及smad3陽(yáng)性著色率(棕色細(xì)胞染色區(qū)域)均明顯降低，見(jiàn)圖5。

圖5 小鼠肝組織TGF-β1, smad2/3表達(dá)免疫組化圖Fig.5 Effect of tangeretin on the TGF-β1/smadspathway in liver fibrosis(×200)

組別nNotch1RBPJHes1Hey1假手術(shù)組101.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00BDL模型組153.84±0.306.02±0.472.44±0.6030.66±8.19橘皮素治療組101.17±0.121.81±0.501.37±0.192.62±0.49單純用藥組100.92±0.0641.27±0.240.86±0.111.35±0.19F75.6442.004.9812.53

3 討 論

臨床上，在肝纖維化階段，患者并無(wú)明顯癥狀，發(fā)展為肝硬化失代償期才會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的臨床表現(xiàn)，檢查結(jié)果常表現(xiàn)為肝酶升高及肝纖維化指標(biāo)異常等。肝移植是根治肝纖維化的有效手段[10]，但臨床實(shí)施存在多方面限制。目前臨床醫(yī)師主要通過(guò)治療原發(fā)病、減少炎癥和宿主免疫反應(yīng)及抑制星狀細(xì)胞活化等方面減緩肝纖維化的進(jìn)展[11]，但由于常用藥物副作用及耐藥性的產(chǎn)生，效果并不理想。近年來(lái)，隨著單藥及有效單體研究的發(fā)展，雷公藤紅素、紅景天苷等藥物逐步進(jìn)入臨床并應(yīng)用于肝纖維化治療[12]。

本研究通過(guò)橘皮素灌胃治療膽汁淤積性肝纖維化小鼠模型，發(fā)現(xiàn)橘皮素治療組小鼠皮膚黏膜黃染程度明顯低于BDL模型組，而Masson染色及天狼星紅染色結(jié)果說(shuō)明橘皮素可減少纖維化膠原沉積，H-E染色顯示橘皮素干預(yù)后肝纖維化病理學(xué)評(píng)分降低。血清中ALT及AST在一定程度上反映肝損害程度，橘皮素治療組肝酶指標(biāo)與BDL組相比明顯降低。常用肝纖維化檢測(cè)指標(biāo)有Ⅲ型前膠原、Ⅳ型膠原、LN、HA，本研究選取LN和HA來(lái)衡量肝纖維化程度，橘皮素治療組血清中LN、HA含量明顯低于BDL模型組，結(jié)果證實(shí)橘皮素對(duì)肝纖維化進(jìn)展具有一定減緩作用。

在膽汁淤積性纖維化過(guò)程中，激活的肝星狀細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并釋放大量TGF-β1，其促進(jìn)纖維化過(guò)程中膠原沉積及細(xì)胞外基質(zhì)生成，并促進(jìn)位于胞質(zhì)內(nèi)下游因子smad2/3的表達(dá)[14-15]。本研究結(jié)果提示，橘皮素藥物干預(yù)可明顯降低BDL所致膽汁淤積性肝纖維化組織中TGF-β1及其下游通路組分smad2/3的表達(dá)。

Notch信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)通路，其由配體(Delta1、Delta2、Jagged1、Jagged2等，受體Notch1-4、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子RBPJ)，靶基因(Hes1、Hey1)等組分構(gòu)成[16]。有報(bào)道稱(chēng)，Notch信號(hào)通路通過(guò)影響肝臟祖細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞分化過(guò)程參與膽汁淤積性肝纖維化形成，并且不同組分在疾病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮不同作用[17-18]。陳川寧[20]研究表明，在乙醛激活肝星狀細(xì)胞中，Notch信號(hào)通路“串話”TGF-β通路對(duì)肝纖維化進(jìn)程具有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，橘皮素治療組較BDL模型組Notch信號(hào)通路組分Notch1、Hes1、Hey1、RBPJ表達(dá)量均有不同程度降低，同時(shí)TGF-β1、smads表達(dá)量也有不同程度降低，說(shuō)明該藥可通過(guò)下調(diào)肝細(xì)胞中Notch信號(hào)通路延緩肝纖維化進(jìn)展及肝星狀細(xì)胞激活，但其具體機(jī)制仍有待深入研究。