張楚怡， 李姝君,2， 黃小玲,3， 趙 倩，林 忻， 俞作仁

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，上海 200120；2. 大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，大連 116044；3. 甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，蘭州 730000)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是最常見(jiàn)的特發(fā)性間質(zhì)性肺炎，確診后的平均存活期不到3年，是危害人類健康的重要疾病，被稱為“非腫瘤的腫瘤”，發(fā)病機(jī)制不明，無(wú)有效的治療方法。

99%的肺表面由肺泡上皮細(xì)胞構(gòu)成，肺泡上皮細(xì)胞包括肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮細(xì)胞。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞占肺細(xì)胞總數(shù)的16%，但僅覆蓋5%的肺泡表面積，具有合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)的功能，對(duì)于維持肺泡的功能和形態(tài)起重要作用。肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞覆蓋95%的肺泡表面積，是氣體交換的主要場(chǎng)所，具有維持肺泡結(jié)構(gòu)的作用。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，受到損傷脫落后，自身不具有增殖和分化的功能，而肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞能通過(guò)有絲分裂、增殖、分化成肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞，修復(fù)受損的肺泡上皮細(xì)胞。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞也具有自我更新和產(chǎn)生肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的能力。ALI/ARDS發(fā)生時(shí)，肺泡上皮細(xì)胞受到損傷，炎癥因子、細(xì)胞因子、趨化因子等進(jìn)入到肺泡，引起肺泡上皮細(xì)胞死亡，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，同時(shí)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、循環(huán)纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型，轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，最終在肺泡中形成瘢痕，導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)破壞。利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，靶向肺泡上皮細(xì)胞防治其纖維化，日益成為該領(lǐng)域研究熱點(diǎn)之一。但是，肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮細(xì)胞在ALI/ARDS和IPF發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等的作用及調(diào)控機(jī)制尚不明確，還有待于進(jìn)一步研究。

轉(zhuǎn)錄因子YY1是Polycomb家族蛋白之一，具有雙重轉(zhuǎn)錄活性和DNA結(jié)合活性。YY1參與多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，包括胚胎形成、組織細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡等。大量的研究結(jié)果證實(shí)，YY1在癌癥和炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。本項(xiàng)目組成員首次發(fā)現(xiàn)YY1在肺纖維化的疾病發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)節(jié)作用，但其分子機(jī)制尚不清楚。在前期工作基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目擬針對(duì)肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮細(xì)胞的功能及調(diào)控機(jī)制的不同，深入研究YY1在肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞炎癥和纖維化發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用和機(jī)制，為推動(dòng)YY1在防治IPF的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

A549、R3/1、HEK293T、H446、H460、H1299細(xì)胞源自美國(guó)ATCC，本項(xiàng)目課題組所在實(shí)驗(yàn)室保持和存養(yǎng)；DMEM培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自中科邁晨(北京)科技有限公司；Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA、TGF-β均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；β-actin、YY1抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；NF-κB抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；Histone抗體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；α-sma抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；TRIzol試劑、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；熒光定量PCR SYBR Green Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；pSG5-YY1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、pLKO-YY1shRNA載體以及相應(yīng)的對(duì)照載體由美國(guó)羅徹斯特大學(xué)合作提供。

儀器6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、T25培養(yǎng)瓶購(gòu)自美國(guó)CORNING公司；熒光倒置顯微鏡、活細(xì)胞工作站購(gòu)自徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司；雙色激光ODYSSEY成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司；7900HT實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI Applied Biosystems公司；電泳槽和電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Red公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) R3/1細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中；HEK293T、A549、H446、H460、H1299細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。雙抗?jié)舛葹榍嗝顾?100U/mL)/鏈霉素(100μg/mL)。細(xì)胞均置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d換新鮮培養(yǎng)基。

1.2.2 RNA提取和qRT-PCR 按試劑說(shuō)明書(shū)，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，并采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)，使用SYBR Green Master Mix進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)指定基因的mRNA水平。以GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化參照，目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)量根據(jù)2-△△Ct計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，QRT-PCR引物如下。α-sma上游引物： 5′-ACTGAGCGTGGCTACT-CCTT-3′，下游引物： 5′-CATCTCGTTCTCGAAGT-CCA-3′；vimentin上游引物： 5′-GTCTTGACCTTG-AACGCAAA-3′，下游引物： 5′-TGGACATGCTG-TTCCTGAAT-3′；YY1上游引物： 5′-GAGCGGCA-AGAAGAGTTACC-3′，下游引物： 5′-TCTTGATC-TGCACCTGCTTC-3′；GAPDH上游引物： 5′-TGC-ACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物： 5′-GGC-ATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

1.2.3 Western印跡法 細(xì)胞加入RIPA裂解液裂解蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每組取50～100μg蛋白，SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用一抗和相應(yīng)的熒光二抗孵育后，在ODYSSEY成像系統(tǒng)上進(jìn)行曝光并記錄。

1.2.4 TGF-β1刺激 R3/1細(xì)胞以5×104/mL密度種于6孔板中，每孔2mL。待細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%密度時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24h，使細(xì)胞同步于靜止期，利用終濃度為5ng/mL的TGF-β1刺激24h。提取細(xì)胞RNA和蛋白，檢測(cè)α-sma、YY1等基因的表達(dá)。

1.2.5 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將R3/1細(xì)胞隨機(jī)分為4組： 空白載體組(pSG5 vector)、過(guò)表達(dá)YY1組(pSG5 YY1)、空白載體加TGF-β1刺激組(pSG5 vector+TGF-β1)、過(guò)表達(dá)YY1加TGF-β1刺激組(pSG5 YY1+TGF-β1)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至6孔板中，用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，操作按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后；加入TGF-β1刺激24h，收集細(xì)胞，開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

R3/1細(xì)胞YY1慢病毒穩(wěn)定株(pLKO YY1-shRNA)和空白載體慢病毒穩(wěn)定株(pLKO Ctrl)各隨機(jī)分為兩組，加或不加TGF-β1刺激24h后，收集細(xì)胞，開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別轉(zhuǎn)染pSG5 vector質(zhì)粒和pSG5 YY1質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48h后，消化細(xì)胞接種于3塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組8個(gè)復(fù)孔，2000個(gè)細(xì)胞/孔，每孔100μL細(xì)胞培養(yǎng)基。12h后細(xì)胞貼壁，作為0h。分別在0、24和48h檢測(cè)細(xì)胞。每孔加入10μL CCK8，3h后搖床振蕩10min，450nm測(cè)吸光度值(A450值)。

1.2.7 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白的分離及制備 收集細(xì)胞沉淀于1.5mL EP管中。每管加入100μL細(xì)胞質(zhì)裂解緩沖液，劇烈振蕩，冰上靜置10min。加入NP40 4μL，渦旋5s后，4℃最大轉(zhuǎn)速離心10min，收集的上清即為胞質(zhì)蛋白。剩余沉淀用300μL PBS沖洗，13300r/min，離心半徑9.6cm，離心3min。棄去上清液，每管加入50μL細(xì)胞核裂解緩沖液。渦旋20s，冰上靜置10min，重復(fù)4次。4℃最大轉(zhuǎn)速離心10min，收集上清即為胞核蛋白。開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞R3/1的纖維化程度與YY1表達(dá)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性

體外培養(yǎng)并觀察肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞R3/1、Ⅱ型上皮細(xì)胞A549以及肺癌細(xì)胞株H446、H460、H1299生長(zhǎng)情況。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)與其他上皮細(xì)胞不同的是，肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞R3/1呈現(xiàn)纖維化長(zhǎng)梭形。分別制備細(xì)胞的RNA，利用QRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞纖維化生物標(biāo)志物α-sma以及vimentin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)α-sma在肺癌細(xì)胞株H446、H460、H1299的表達(dá)水平極低，在A549細(xì)胞適度表達(dá)，而在R3/1細(xì)胞特異高表達(dá)，其在R3/1細(xì)胞中mRNA水平是在A549細(xì)胞的25倍左右，見(jiàn)圖1A，同樣，vimentin mRNA在R3/1細(xì)胞中的表達(dá)也遠(yuǎn)高于A549細(xì)胞，見(jiàn)圖1B。

本課題組以前的工作發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子YY1對(duì)急性肺損傷以及肺纖維化具有重要調(diào)控作用，YY1在肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮細(xì)胞是否有相同的功能和機(jī)制尚不明確。

本研究制備了肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞R3/1以及Ⅱ型上皮細(xì)胞A549的蛋白，通過(guò)蛋白印跡檢測(cè)YY1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)YY1在R3/1的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其在A549細(xì)胞的表達(dá)水平，見(jiàn)圖1C。

可見(jiàn)，在肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞R3/1中，細(xì)胞纖維化生物標(biāo)志物高表達(dá)，YY1低表達(dá)，二者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。

圖1 肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞R3/1的纖維化程度與YY1表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)Fig.1 The degree of fibrosis is negatively correlated withthe expression of YY1 in type Ⅰ AEC R3/1A-B： 利用QRT-PCR，檢測(cè)R3/1、A549、H446、H460、H1299中，α-sma的mRNA水平(A)及vimentin的mRNA水平(B)；C： 利用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)，檢測(cè)YY1在A549和R3/1細(xì)胞中的蛋白水平

2.2 過(guò)表達(dá)YY1抑制細(xì)胞纖維化和細(xì)胞增殖

為了驗(yàn)證YY1在肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞的調(diào)控功能，本研究制備了YY1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染R3/1細(xì)胞，通過(guò)熒光定量PCR以及蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)技術(shù)，證實(shí)了轉(zhuǎn)染后的R3/1細(xì)胞YY1表達(dá)升高3倍以上，見(jiàn)圖2。進(jìn)一步功能研究發(fā)現(xiàn)，R3/1細(xì)胞過(guò)表達(dá)YY1，能夠抑制纖維化生物標(biāo)志物α-sma的表達(dá)，QRT-PCR結(jié)果顯示YY1過(guò)表達(dá)組中α-sma的表達(dá)為vector對(duì)照組的23.7%。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在R3/1細(xì)胞中，YY1能夠顯著抑制細(xì)胞增殖，見(jiàn)圖3。

急性肺損傷患者，炎癥因子和細(xì)胞因子等進(jìn)入到肺泡，引起肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥、纖維化、甚至凋亡，纖維化的同時(shí)往往伴隨著細(xì)胞增殖。上述研究結(jié)果表明，YY1在肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞R3/1抑制纖維化，抑制細(xì)胞增殖。

圖2 Western印跡法檢測(cè)R3/1細(xì)胞轉(zhuǎn)染YY1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后YY1蛋白水平變化Fig.2 The protein levels of YY1 in R3/1 cells after transfected with YY1 plasmid were analyzed by Western blotting

圖3 過(guò)表達(dá)YY1抑制R3/1細(xì)胞增殖Fig.3 Overexpression of YY1 reduced the cellularproliferation in R3/1 cells

2.3 YY1負(fù)向調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞R3/1纖維化

本研究用終濃度5ng/mL的TGF-β1刺激R3/1細(xì)胞，24h后，在mRNA和蛋白水平上檢測(cè)處理前后α-sma和YY1的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞纖維化生物標(biāo)志物α-sma的表達(dá)升高6倍以上，而YY1表達(dá)沒(méi)有顯著性變化，見(jiàn)圖4A。利用YY1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞，通過(guò)TGF-β1刺激后，在mRNA水平以及蛋白水平，分別檢測(cè)了細(xì)胞纖維化生物標(biāo)志物α-sma以及vimentin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)YY1過(guò)表達(dá)能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞纖維化，見(jiàn)圖4B、4C。

為了進(jìn)一步確認(rèn)YY1對(duì)肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞纖維化的調(diào)控功能，本研究利用YY1 shRNA病毒載體，轉(zhuǎn)染R3/1細(xì)胞，穩(wěn)定敲低細(xì)胞內(nèi)YY1的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞纖維化驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)YY1的特異敲低能夠顯著促進(jìn)α-sma的表達(dá)，并能夠協(xié)同及促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的R3/1細(xì)胞纖維化，見(jiàn)圖4D。

2.4 YY1抑制TGF-β1誘導(dǎo)的NF-κB質(zhì)核移位

為了闡明YY1在R3/1細(xì)胞調(diào)控纖維化的分子機(jī)制，對(duì)TGF-β1處理前及處理后的R3/1細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白的分離，并利用細(xì)胞質(zhì)蛋白標(biāo)志物β-actin以及細(xì)胞核蛋白標(biāo)志物Histone進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)核分離的驗(yàn)證和鑒定(圖5A)。利用蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)NF-κB的表達(dá)，表明R3/1細(xì)胞中NF-κB主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，TGF-β1刺激后，促進(jìn)野生型R3/1細(xì)胞NF-κB的質(zhì)核移位(圖5B第4泳道vs第2泳道)，但YY1過(guò)表達(dá)抑制了該過(guò)程(圖5B第5泳道vs第3泳道)。

圖4 YY1負(fù)向調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞R3/1纖維化Fig.4 YY1 negatively regulated pulmonary fibrosis induced by TGF-β1 in type Ⅰ AEC R3/1A： TGF-β1處理前后α-sma和YY1蛋白水平變化；B： 過(guò)表達(dá)YY1對(duì)TGF-β1處理前后α-sma基因表達(dá)的影響；C： 敲低YY1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)α-sma和vimentin表達(dá)的影響；D： 過(guò)表達(dá)YY1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)α-sma和vimentin表達(dá)的影響

圖5 YY1抑制R3/1細(xì)胞中TGF-β1誘導(dǎo)的NF-κB質(zhì)核移位Fig.5 YY1 inhibited relocalization of the NF-κB protein from the cytoplasm to the nucleus induced by TGF-β1 in R3/1 cellsA： 蛋白質(zhì)印跡法鑒定R3/1細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白的分離；B： 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)YY1基因過(guò)表達(dá)影響TGF-β1誘導(dǎo)的NF-κB質(zhì)核移位的功能

3 討 論

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征和特發(fā)性肺纖維化一直是呼吸和危重醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。主要表現(xiàn)為呼吸功能衰竭，死亡率高。由于肺器官的復(fù)雜性，手術(shù)治療存在極大的危險(xiǎn)性和復(fù)雜性。長(zhǎng)期以來(lái)，糖皮質(zhì)激素被作為IPF首選藥物應(yīng)用于臨床。雖然對(duì)患者肺功能指標(biāo)有所改善，但是對(duì)患者生存率沒(méi)有積極作用。因此，美國(guó)及一些歐洲國(guó)家IPF臨床治療指南自2002年以后不推薦類固醇藥物作為主要治療藥物[10]。雖然吡非尼酮和尼達(dá)尼布為抗纖維化治療帶來(lái)了一定的福音，但是還不能從源頭阻止和逆轉(zhuǎn)肺纖維過(guò)程[11-12]?；虬邢蛑委煴灰曌髦委煼渭膊∽钣邢Ｍ姆椒ㄖ弧７闻茛?、Ⅱ型上皮細(xì)胞功能障礙是導(dǎo)致急性肺損傷和肺纖維化的重要原因，闡明疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，這兩個(gè)亞型肺泡上皮細(xì)胞的獨(dú)特功能及調(diào)控機(jī)制，有助于尋找治療急性肺損傷和肺纖維化的特異靶點(diǎn)。

多種細(xì)胞因子參與肺泡細(xì)胞纖維化的發(fā)生，其中TGF-β1起關(guān)鍵性的作用[13]。TGF-β1調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、基質(zhì)產(chǎn)生和凋亡;在肺組織損傷或炎癥時(shí)，肺泡細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等都能產(chǎn)生及釋放TGF-β1，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化[14]。TGF-β1通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞基質(zhì)成分的表達(dá)而促進(jìn)基質(zhì)的產(chǎn)生，在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生有利于組織的損傷修復(fù)，病理?xiàng)l件下，TGF-β1過(guò)表達(dá)有可能導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度產(chǎn)生而發(fā)生纖維化。體外研究中，TGF-β1刺激通常被用于細(xì)胞炎癥及纖維化模型的制備。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1刺激R3/1細(xì)胞后，成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-sma表達(dá)也明顯增高，證實(shí)TGF-β1能夠誘導(dǎo)R3/1細(xì)胞纖維化。

轉(zhuǎn)錄因子YY1具有雙重轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)至今已超過(guò)20年。其在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中所表現(xiàn)出的關(guān)鍵作用日益引起人們的重視。YY1最初是在研究真核細(xì)胞DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)現(xiàn)的[15]，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)YY1能夠調(diào)控癌基因，以轉(zhuǎn)錄抑制子、增強(qiáng)子等潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控角色，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[16]。YY1表達(dá)在TNF-α和TGF-β1刺激、IPF患者以及兩種肺纖維化動(dòng)物模型中均有異常，提示YY1對(duì)肺泡細(xì)胞纖維化發(fā)生、IPF的發(fā)病等有重要調(diào)控功能。本研究構(gòu)建了YY1過(guò)表達(dá)R3/1細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)株和YY1基因下調(diào)的R3/1細(xì)胞慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株，從上調(diào)和下調(diào)兩個(gè)方面探討YY1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞EMT的影響和機(jī)制。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)YY1會(huì)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的R3/1細(xì)胞纖維化標(biāo)志分子α-sma的表達(dá)。提示，YY1能夠抑制肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞纖維化。

TGF-β1刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥及纖維化發(fā)生，通常是通過(guò)激活NF-κB，促進(jìn)活化的NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控炎性基因以及纖維化基因的表達(dá)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1促進(jìn)R3/1細(xì)胞核中NF-κB的表達(dá)，但YY1過(guò)表達(dá)會(huì)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的NF-κB入核，提示YY1影響TGF-β1刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞NF-κB質(zhì)核移位。

本研究通過(guò)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞纖維化模型發(fā)現(xiàn)，YY1能抑制肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞纖維化，主要作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的NF-κB從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制其對(duì)下游纖維化基因的轉(zhuǎn)錄激活。本項(xiàng)目組其他工作已經(jīng)證實(shí)YY1對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞纖維化的特異誘導(dǎo)作用。本研究表明YY1對(duì)肺泡Ⅰ型及Ⅱ型上皮細(xì)胞纖維化具有不同的調(diào)控功能，為今后肺泡細(xì)胞亞型特異性的靶向研究及IPF的基因治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但仍需要通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究YY1在肺纖維化中具體的分子機(jī)制及治療作用，為YY1作為肺疾病的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

(感謝美國(guó)羅徹斯特大學(xué)合作提供pSG5-YY1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、pLKO-YY1shRNA載體、以及相應(yīng)的對(duì)照載體)