陳迎春，吳新穎，蔣錫龍，張倩倩，李益，慕茜，楊立英，王詠梅，張加魁*，王鵬飛*

（山東省葡萄研究院/農(nóng)業(yè)部華東都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100）

在生物細(xì)胞內(nèi)，除了含有信使RNA（messenger RNA，mRNA）之外，還含有各種類型的非編碼RNA。例如microRNA（miRNA），小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），反式作用RNA（trans-acting siRNA，tasiRNA）以及長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）等。而環(huán)狀RNA（circRNAs）則是一類最新發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特的非編碼RNA[1-3]。而在其起初發(fā)現(xiàn)后的十幾年內(nèi)，環(huán)狀RNA曾被認(rèn)為是一種RNA剪切拼接的錯(cuò)誤[4]。目前，隨著高通量深度測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，大量的環(huán)狀RNA在動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)。研究顯示環(huán)狀RNA在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定并高水平表達(dá)，而這些被發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA也被證實(shí)在很多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[1,2,6-8]。

環(huán)狀RNA可以起源于外顯子（此類為外顯子起源環(huán)狀RNA），內(nèi)含子（此類為內(nèi)含子環(huán)狀RNA）以及基因間區(qū)[9-11]。也可以是部分源自內(nèi)含子而部分源自外顯子（此類為外顯子-內(nèi)含子起源RNA，exon-intron circRNA，EIciRNA）[12-15]，甚至可以源自轉(zhuǎn)運(yùn)RNA

（tRNA）的內(nèi)含子（此類為tricRNA）[16]。環(huán)狀RNA是由于RNA頭與尾的反向剪切而形成的。與線性RNA不同，環(huán)狀RNA不含有5'端的帽子結(jié)構(gòu)和3'端的尾部，其形態(tài)是上游RNA片段和下游RNA片段相連形成封閉的環(huán)狀[10]。因此，環(huán)狀RNA不會(huì)被RNA酶R降解[11]。然而大部分的環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)是源自蛋白編碼基因的外顯子[17]。研究表明序列的互補(bǔ)及外顯子跳躍是環(huán)狀RNA形成的原因[18-22]。而有的研究顯示，環(huán)狀RNA也可以通過含外顯子的套索前體產(chǎn)生[23]。此外，RNA綁定蛋白也涉及環(huán)狀RNA的形成過程。例如MBNL1、ADAR1及Quaking也可以在環(huán)狀RNA合成中起到重要作用[24-26]。而環(huán)狀RNA一旦被合成，由于其缺少起始密碼子和終止密碼子，因而不能編碼蛋白序列[24,26]。

環(huán)狀RNA目前被發(fā)現(xiàn)的功能主要是作為miRNA海綿。例如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ciRS-7（也被稱作CDR1as），就被發(fā)現(xiàn)包含超過70個(gè)保守的miR7結(jié)合位點(diǎn)[27]。由于ciRS-7對(duì)miR7的結(jié)合，使得miR-7的活性大大降低，從而增加miR-7靶基因的表達(dá)水平。而環(huán)狀NRAciRS-7一旦被降解，miR7則會(huì)被釋放[28]。Sry則是另一種被證實(shí)為miRNA海綿的睪丸特異表達(dá)的環(huán)狀RNA[29]。該環(huán)狀RNA含有16個(gè)miR138的綁定位點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)增加了對(duì)miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解，并增加了我們對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）網(wǎng)絡(luò)機(jī)制的認(rèn)識(shí)[30]。環(huán)狀RNA也可以作為一種蛋白海綿。例如果蠅和人中的環(huán)狀RNA circMbl。這種環(huán)狀RNA上存在許多的muscle blind蛋白結(jié)合位點(diǎn)[26]。環(huán)狀RNA circMbl可以清除多余的muscle blind蛋白，從而調(diào)控該蛋白的表達(dá)水平[26]。有的環(huán)狀RNA（ecircRNA）可作為“mRNA陷阱”，隔離翻譯起始站點(diǎn)，從而導(dǎo)致線性mRNA無法翻譯。例如，小鼠formin（FMN）基因可產(chǎn)生作為mRNA陷阱的ecircRNA[31]。此外，環(huán)狀RNA可以通過與Pol II的互作從而正調(diào)控Pol II轉(zhuǎn)錄[14]。最近研究還顯示，EIciRNAs可以通過與U1 snRNA的互作微調(diào)控父母本基因的表達(dá)[16]。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了環(huán)狀RNA在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用，但也揭示了特異EIciRNA和U1 snRNA相互作用的調(diào)控機(jī)制。總的來說，環(huán)狀RNA與轉(zhuǎn)錄機(jī)制相互作用細(xì)胞中基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了新的觀點(diǎn)。

在哺乳動(dòng)物中，環(huán)狀RNA在突觸中高表達(dá)，并且在神經(jīng)元分化過程中差異表達(dá)[26]。環(huán)狀RNA在許多腫瘤中也有廣泛的表達(dá)，其表達(dá)水平與人類腫瘤的臨床特征密切相關(guān)。因此，環(huán)狀RNA在癌癥中將可能被作為一種疾病的生物標(biāo)志物[32]。而與對(duì)動(dòng)物環(huán)狀RNA的研究相比，對(duì)植物中環(huán)狀RNA的研究相對(duì)較少[33]。在水稻中，一些環(huán)狀RNA在磷充足和磷饑餓的條件下差異表達(dá)，顯示了環(huán)狀RNA可能在對(duì)磷饑餓的應(yīng)激反應(yīng)中起到作用[34]。這些結(jié)果表明，環(huán)狀RNA也在植物中大量存在，并且可能在非生物脅迫響應(yīng)中起到重要的作用。

葡萄是一種重要的果樹。而目前對(duì)葡萄環(huán)狀RNA的研究尚未開展。本研究將利用高通量測(cè)序及計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的方法鑒定葡萄葉中環(huán)狀RNA的數(shù)量、種類以及在葉中表達(dá)水平。并探索其來源的基因及其功能。并初步預(yù)測(cè)這些葡萄環(huán)狀RNA可能靶向的miRNA。本研究將豐富對(duì)葡萄中環(huán)狀RNA的了解，并為葡萄miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集釀酒葡萄品種‘赤霞珠’一年生自根苗的幼葉，用于總RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

利用TRIZOL試劑盒（購(gòu)自Invitrogen公司,USA）提取幼葉的總RNA，操作步驟按照試劑盒說明書。

1.2.2 環(huán)狀RNA文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序

用Ribo-ZeroTM Magnetic kit植物葉片專用試劑盒去除總RNA中rRNA。委托華大基因公司構(gòu)建環(huán)狀RNA測(cè)序文庫(kù)并進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq 2000系統(tǒng)。

1.2.3 生物信息學(xué)法鑒定環(huán)狀RNA

葡萄基因組序列被下載自葡萄基因組網(wǎng)站（http：//genomes.cribi.unipd.it/grape/index.php）。得到的clean read用Bowtie2軟件比對(duì)到葡萄基因組上，去除不能比對(duì)上的read，留下能比對(duì)到基因組上的read進(jìn)行下一步分析。利用CIRI和find circ軟件分析比對(duì)到基因組上的read，找到接合位點(diǎn)測(cè)序讀段對(duì)。CIRI通過兩次掃描比對(duì)生成的SAM（Sequence Alignment/Map）文件來檢測(cè)circRNA。最后，經(jīng)過一系列過濾得到候選的環(huán)狀RNA。其本質(zhì)就是找到正確的接合位點(diǎn)測(cè)序讀段對(duì)，而依據(jù)接合位點(diǎn)測(cè)序讀段對(duì)判斷出這是環(huán)狀RNA的一部分，從而鑒定發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA。

1.2.4 環(huán)狀RNA表達(dá)量的分析

根據(jù)比對(duì)環(huán)狀RNA的接合位點(diǎn)測(cè)序讀段對(duì)數(shù)來計(jì)算環(huán)狀RNA的表達(dá)量，由于使用了CIRI、fnd circ這兩個(gè)軟件來預(yù)測(cè)，取兩者最終的接合位點(diǎn)測(cè)序讀段對(duì)數(shù)結(jié)果的平均值。本文采用RPB作為環(huán)狀RNA的均一化表達(dá)量數(shù)值。RPB＝比對(duì)上基因組的所有reads標(biāo)準(zhǔn)化到十億后跨過back-spliced位點(diǎn)的junction reads數(shù)目。

1.2.5 Nr和GO注釋與分類，KEGG注釋及KEGG pathway通路分析

利用blastP軟件在NCBI Nr數(shù)據(jù)庫(kù)檢索涉及基因編碼蛋白的功能注釋。利用在線軟件Blast2Go（https：//www.blast2go.com/）對(duì)該研究涉及基因編碼的蛋白進(jìn)行分析，搜索其對(duì)應(yīng)的GO功能注釋。然后利用在線軟件BGI WEGO（http：//wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl）對(duì)這些注釋過的基因進(jìn)行分類。利用KEGG在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.kegg.jp/kegg/ko.html）中的線軟件BlastKOALA（http：//www.kegg.jp/blastkoala/）對(duì)涉及的基因進(jìn)行比對(duì)分析，搜索其對(duì)應(yīng)的KEGG功能注釋及KO號(hào)。利用這些基因KO號(hào)在KO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.kegg.jp/kegg/ko.html）中進(jìn)行搜索，從而比對(duì)到這些基因所處的KEGG 通路。

1.2.6 靶向環(huán)狀RNA的miRNA初步預(yù)測(cè)及miRNA靶基因的預(yù)測(cè)

將利用psRobot（http：//omicslab.genetics.ac.cn/psRobot/）和psRNATarget（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/）在線軟件預(yù)測(cè)miRNA的靶基因以及與miRNA可以結(jié)合的環(huán)狀RNA。葡萄miRNA序列下載自miRbase（http：//www.mirbase.org/）。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)狀RNA的鑒定及其表達(dá)分析

綜合兩個(gè)軟件的鑒定結(jié)果，在葡萄幼葉中共鑒定出1172個(gè)環(huán)狀RNA。根據(jù)其在基因組上的起始、終止位置定位，將其分為基因來源的環(huán)狀RNA和基因間區(qū)來源的環(huán)狀RNA。其中基因來源的環(huán)狀RNA有1147個(gè)，這些環(huán)狀RNA來源于1478個(gè)蛋白編碼基因。基因間區(qū)來源的環(huán)狀RNA有25個(gè)。這些環(huán)狀RNA在基因組上的位置顯示，其在葡萄的各個(gè)染色體上均有分布。暫時(shí)以這些葡萄環(huán)狀RNA的染色體號(hào)，及在染色體上的起始、終止位置命名，作為其ID。

通過分析這些葡萄環(huán)狀R N A表達(dá)量認(rèn)為，表達(dá)量最高的環(huán)狀RNA為chr12∶3260512|3271102，其表達(dá)量（R P B）為5 0 3 1 3；表達(dá)量第二高的為c h r 6∶5 6 2 2 4 1 3|5 6 2 9 7 5 6；第三高的為chr4∶3368165|3380481。在這些環(huán)狀RNA中，表達(dá)量最低的環(huán)狀RNA表達(dá)量（RPB）為81。

2.2 環(huán)狀RNA來源基因的Nr，GO和KEGG注釋分析

我們分析了這些葡萄環(huán)狀R N A來源基因的功能。Nr注釋結(jié)果顯示，這些環(huán)狀RNA來源基因的功能注釋為942種。這些基因中，有的具有抗病相關(guān)功能，例如抗TMV蛋白N，抗病基因座類受體蛋白激酶，抗病蛋白（VIT_201s0011g01110，CircRNA-chr1∶968621|979574）。有的與發(fā)育相關(guān)，例如類細(xì)胞分裂周期蛋白5。有的與激素信號(hào)相關(guān)，例如AFR。有的與植物抗逆相關(guān)，例如hsp70。有的與表觀修飾相關(guān)，例如DNA（胞嘧啶-5）甲基轉(zhuǎn)移酶1。一些環(huán)狀RNA來源于轉(zhuǎn)錄因子家族，例如NAC轉(zhuǎn)錄因子家族，GATA轉(zhuǎn)錄因子家族。此外，這些環(huán)狀RNA的來源基因還包括查爾酮合成酶、鯊烯合酶、細(xì)胞色素 P450 CYP72A219、LEAF RUST 10、NAD(P)H脫氫酶、質(zhì)磷酸磷酸酶2同種型X2、肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白3同種型X1。

GO注釋結(jié)果顯示，這些環(huán)狀RNA來源基因可以被分為3個(gè)大類：生物學(xué)過程、分子功能以及細(xì)胞組分。這些基因被注釋為細(xì)胞組分的有358個(gè)，被注釋為分子功能的為431個(gè)，而被注釋為生物學(xué)過程的有341個(gè)。這些基因在細(xì)胞組分大類下又被分為14個(gè)條目。其中大多數(shù)基因被注釋為細(xì)胞、細(xì)胞部分以及細(xì)胞器。這些基因在分子功能大類下又可被分為8個(gè)條目。其中大多數(shù)基因被注釋為催化活性，綁定及刺激反應(yīng)。這些基因在生物學(xué)過程大類下又可被分為16個(gè)條目，其中大多數(shù)基因被注釋為代謝過程、細(xì)胞過程及定位（圖1）。

圖1 環(huán)狀RNA來源基因的GO分類Figure 1 GO classification of circular RNA-derived genes

KEGG注釋結(jié)果顯示，這些環(huán)狀RNA來源基因可以被比對(duì)到276個(gè)KEGG通路上，涉及的生物學(xué)過程包括：代謝途徑、次級(jí)代謝途徑、碳代謝、RNA降解途徑、剪切體及核糖體等生物學(xué)過程（表1）。

表1 環(huán)狀RNA來源基因富集在KEGG通路中的前20種通路Table 1 Top 20 pathways in which the circular RNA-derived genes are enriched in the KEGG pathway

2.3 與環(huán)狀RNA結(jié)合miRNA的鑒定與分析

根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，共鑒定出可以靶向這些環(huán)狀RNA的miRNA73個(gè)，包括vvi-miR393a、vvi-miR393b、vvi-miR396a、vvi-miR535b、vvi-miR845c、vvi-miR156a等。涉及最大的miRNA家族為miR156、miR166家族。在這些環(huán)狀RNA中，能被miRNA靶向的僅有74個(gè)。我們又利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了這73個(gè)miRNA的靶基因，共有710個(gè)靶基因被鑒定。很多涉及的miRNA都對(duì)應(yīng)了10以上靶基因，例如vvi-miR3630-3p，其靶基因包括13個(gè)，分別是VIT_208s0040g00990、VIT_207s0031g02270、VIT_207s0005g05420、VIT_204s0023g00310、VIT_202s0033g00870、VIT_202s0033g00850、VIT_202s0033g00840、VIT_202s0033g00800、VIT_202s0033g00790、VIT_202s0033g00700、VIT_202s0033g00670、VIT_202s0033g00660及VIT_216s0098g00970。vvi-miR3630-3p靶向的環(huán)狀RNA為CircRNA- chr2：15496105|15589650。該環(huán)狀RNA的來源基因?yàn)閂IT_202s0033g00850，也是vvi-miR3630-3p靶基因之一。這些靶基因涉及許多生物學(xué)功能，有的具有抗逆相關(guān)功能，例如HSP90.1，HSP83及LEA2。有的具有抗病相關(guān)功能，例如類RPP13蛋白1及抗TMV resistance類 N-蛋白。有的與激素信號(hào)相關(guān)，例如類生長(zhǎng)素蛋白、AFR18、AFR23、類生長(zhǎng)四轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、生長(zhǎng)素誘導(dǎo)單筆及乙烯不敏感蛋白 2。有的與發(fā)育相關(guān)，例如細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制蛋白、細(xì)胞分裂周期20.2、類APC復(fù)合物輔因子、細(xì)胞分裂蛋白FtsZ同系物1、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子1。很多靶基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子，例如類AP2、TOE3、ERF038、ERF084、類GATA24-like、myb、NAC25、bHLH77及GAMYB。此外，這些靶基因還包括類黃酮3',5'-羥化酶2、SPL16、SPL6和SPL7，及跨膜蛋白45B。而SPL基因和未知功能的基因占據(jù)最多比例。

GO注釋結(jié)果顯示，這些靶基因也可以被分為3個(gè)大類：分別為其中被注釋為細(xì)胞組分的有516個(gè)，被注釋為分子功能的為559個(gè)，而被注釋為生物學(xué)過程的有528個(gè)。在細(xì)胞組分大類下又可被分為16個(gè)條目，其中大多數(shù)靶基因被注釋為細(xì)胞、細(xì)胞部分以及細(xì)胞器；在分子功能大類下又可被分為12個(gè)條目，其中大多數(shù)基因被注釋為催化活性、綁定及生物調(diào)控；在生物學(xué)過程大類下又可被分為30個(gè)條目，其中大多數(shù)靶基因被注釋為代謝過程、細(xì)胞過程及刺激反應(yīng)，圖2。

圖2 靶基因的GO分類Figure 2 GO classification of target genes

KEGG注釋結(jié)果顯示，這些靶基因可以被比對(duì)到184個(gè)KEGG通路上，涉及的生物學(xué)過程包括：代謝途徑、次級(jí)代謝途徑，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，植物與病原菌互作途徑，泛素介導(dǎo)的蛋白水解及碳代謝等生物學(xué)過程（表2）。

表2 靶基因富集在KEGG通路中的前20種通路Table 2 Top 20 pathways in which the target genes are enriched in the KEGG pathway

3 討論與結(jié)論

在本研究中，共鑒定了1172個(gè)葡萄幼葉中的環(huán)狀RNA。之前的研究顯示，Ye等在水稻和擬南芥中鑒定出12037個(gè)和6012個(gè)環(huán)狀RNA[34]。Lu等報(bào)道了2354個(gè)水稻中的環(huán)狀RNA[35]。Wang等在小麥中分離出88個(gè)環(huán)狀RNA[36]。Zuo等在番茄中發(fā)現(xiàn)854個(gè)環(huán)狀RNA，其中163個(gè)環(huán)狀RNA顯示出了對(duì)低溫的響應(yīng)[38]。Zhao等在大豆中發(fā)現(xiàn)了5372個(gè)環(huán)狀RNA[37]。我們?cè)谄咸阎需b定的環(huán)狀RNA數(shù)目與番茄相似，比其他物種少。這可能是由于我們只選取了一個(gè)組織進(jìn)行鑒定。

被鑒定環(huán)狀RNA來源的基因涉及很多功能，包括抗逆、抗病、發(fā)育等。目前已知的環(huán)狀RNA一個(gè)重要功能就是作為CeRNA機(jī)制的一部分，通過參與調(diào)控miRNA來調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)[28]。因此分析這些環(huán)狀RNA可能涉及的miRNA，發(fā)現(xiàn)這些環(huán)狀RNA可以結(jié)合73種葡萄miRNA。這1172個(gè)環(huán)狀RNA中有74個(gè)可以結(jié)合miRNA，大部分不能結(jié)合。說明可能很多環(huán)狀RNA不涉及ceRNA機(jī)制。這些能結(jié)合miRNA的環(huán)狀RNA證明在葡萄中也存在ceRNA機(jī)制，即“環(huán)狀RNA-miRNA-靶基因”的三聯(lián)單元。例如“CircRNA-chr2：15496105|15589650-vvi-miR3630-3p-靶基因”單元比較復(fù)雜，涉及的靶基因較多。

我們比較了靶基因和環(huán)狀RNA來源基因，發(fā)現(xiàn)有很多功能類似，但是也有很多功能不同。GO分析顯示二者最富集的條目都是細(xì)胞、細(xì)胞部分、細(xì)胞器、催化活性及綁定。但是二者被注釋的條目種類差別很大。KEGG分析顯示二者所包含成員被比對(duì)到的KEGG通路中種類也有所不同。例如只有環(huán)狀RNA來源基因中有成員可以被定位到剪切體及核糖體通路，而只有miRNA靶基因中有成員可以被比對(duì)到植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，植物與病原菌互作通路及泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路。

本結(jié)果顯示，葡萄中有限的或較少的環(huán)狀RNA可以通過調(diào)控miRNA來調(diào)控更多不同種類靶基因，從而發(fā)揮多種功能。而預(yù)測(cè)環(huán)狀RNA結(jié)合miRNA方法，主要是檢測(cè)本測(cè)序得到的接合位點(diǎn)的測(cè)序讀段對(duì)序列上的miRNA結(jié)合位點(diǎn)。如果將來能夠通過實(shí)驗(yàn)確定全部環(huán)狀RNA的完整序列，則可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的miRNA結(jié)合位點(diǎn)。