黃倩，鄭曉吉,*，史學(xué)偉，單春會(huì)，王順利

（1. 石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000；2. 新疆唐庭霞露酒莊有限公司，新疆五家渠 831300）

現(xiàn)代葡萄酒的生產(chǎn)過(guò)程中，葡萄酒泥中的廢酵母是葡萄酒釀造時(shí)的主要副產(chǎn)物之一，在酵母發(fā)酵后葡萄酒泥通常直接排放至自然環(huán)境中，造成很大的生物資源浪費(fèi)和生態(tài)環(huán)境污染。葡萄酒泥廢酵母中含有大量谷胱甘肽（Glutathione，GSH）[1]，若得以提取可保護(hù)環(huán)境且具有廣闊的商業(yè)前景。谷胱甘肽由L-谷氨酸、甘氨酸和L-半胱氨酸三個(gè)氨基酸經(jīng)肽鍵脫水縮合而成，含有大量的γ-谷氨?；蛶€基生物活性基團(tuán)。GSH在多種氧化還原反應(yīng)中作為一種還原劑存在，對(duì)部分外源性毒性物質(zhì)如有機(jī)磷、有機(jī)氯、農(nóng)藥等具有解毒作用，可用來(lái)治療肝臟等人體解毒性器臟的損傷，延緩中老年人的細(xì)胞衰老，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的分裂和活性，從而增強(qiáng)特異性免疫等。故GSH在醫(yī)學(xué)藥學(xué)、食品設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)和保存以及化妝品等領(lǐng)域的需求量不斷增加，具有廣闊的市場(chǎng)前景和經(jīng)濟(jì)效益[2]。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于GSH的制備方法主要有：高壓均質(zhì)法、高壓脈沖電場(chǎng)法、研磨法、酶法、超聲波法等。高壓均質(zhì)法優(yōu)點(diǎn)是一次性處理量大、生產(chǎn)效率高、過(guò)程簡(jiǎn)單方便，但破壁后提取的GSH雜質(zhì)含量太高，產(chǎn)品的純度過(guò)低無(wú)法達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求。高壓脈沖法能耗低、處理時(shí)間短、不會(huì)造成遺傳物質(zhì)變性，同時(shí)使得浸提液的純度高，但由于設(shè)備昂貴處理量小，不能大規(guī)模的應(yīng)用到工廠生產(chǎn)中?；瘜W(xué)方法是利用細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的組成結(jié)構(gòu)使胞內(nèi)需要提取的成分溶出，但目前由于使用的試劑為不易處理的化學(xué)溶劑，對(duì)環(huán)境影響較大，且提取過(guò)程中分解細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，導(dǎo)致提取物不單一，無(wú)法達(dá)到分離提純的目的。溶解法是利用某些有機(jī)溶劑對(duì)酵母細(xì)胞壁的成分具有溶解作用，可專一性浸提目的細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)，且提取效率高，對(duì)環(huán)境的影響較小。

故本試驗(yàn)采取溶解法提取GSH，提取試劑為乙醇。乙醇能順利通過(guò)酵母細(xì)胞的線粒體內(nèi)膜、外膜以及細(xì)胞質(zhì)膜，且不會(huì)像其他化學(xué)試劑以破壞細(xì)胞壁的三層膜的前提通過(guò)細(xì)胞的三層膜[3]。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，利用熱水法和乙醇法提取釀酒酵母中的GSH，乙醇提取法得到的GSH提取量最高。雖然乙醇提取法浸提時(shí)間較長(zhǎng)，但離心時(shí)間得到縮短，雜質(zhì)含量較低，且GSH的損失也相對(duì)較少[4]。這樣不僅對(duì)GSH進(jìn)行了純化，還節(jié)約了資源和能源。Xiong等[5]研究發(fā)現(xiàn)，體積分?jǐn)?shù)為25%的乙醇能達(dá)到對(duì)高密度釀酒發(fā)酵后的酵母細(xì)胞提取GSH的最大值，且最高提取率達(dá)到0.31%。李雙石等[6]發(fā)現(xiàn)，對(duì)葡萄酒泥廢酵母的最佳處理?xiàng)l件是提取溫度50 ℃、時(shí)間60 min、添加量10 mL時(shí)，能得到最多的GSH提取量。故本試驗(yàn)在設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)其他變量取上述研究的最優(yōu)值，對(duì)單一變量進(jìn)行定性研究。為葡萄酒廢酵母提取谷胱甘肽的生產(chǎn)提供優(yōu)化數(shù)據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料及試劑

葡萄酒廢酵母泥，新疆張?jiān)Ｌ熘槠咸丫茦I(yè)有限公司；Tris試劑，Amresco公司；5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）試劑，美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 儀器及設(shè)備

80目篩網(wǎng)：安平縣篩網(wǎng)絲網(wǎng)有限公司；J-26XP冷凍離心分離機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；SP-756P紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：浙江賽德儀器；SHC A-C水浴恒溫振蕩器：蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；移液器：北京卓信偉業(yè)科技有限公司；電子天平：JCS001，天衡儀器制造廠；分析天平：JJ223BC，雙杰測(cè)試儀器廠；96孔酶標(biāo)板：豐源器材有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄酒泥的處理

去離子水與葡萄酒泥混合體積比為1∶1，對(duì)混合液進(jìn)行80目篩網(wǎng)篩分。取篩分液于離心機(jī)中，4000 r/min下離心分離20 min，取上清液用去離子水溶解后繼續(xù)離心分離，重復(fù)上述步驟，直至上清液澄清所得的沉淀為白色為止。收集沉淀，將沉淀物置于55 ℃鼓風(fēng)干燥箱鼓風(fēng)干燥至能磨粉處理，磨粉后保存于干燥陰暗條件下。

1.2.2 乙醇法提取

稱取酒泥廢酵母干粉1.00 g于燒杯中，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為25%的乙醇溶液，于恒溫水浴鍋50 ℃水浴攪拌60 min，離心冷卻至室溫的浸提液，待浸提液冷卻至室溫，于3000 r/min離心分離10 min，得到上清液和酵母細(xì)胞沉淀，所得上清液即為GSH浸提液。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別固定其他因素水平，考察料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（15%、25%、35%、45%、55%）、浸提時(shí)間（20、40、60、80、100 min）和浸提溫度（30、40、50、60、70 ℃）等因素對(duì)谷胱甘肽提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的結(jié)果，取3個(gè)相鄰的顯著點(diǎn)確定酒泥廢酵母谷胱甘肽提取優(yōu)化設(shè)計(jì)的試驗(yàn)因素和水平，利用Design-Expert軟件對(duì)谷胱甘肽提取進(jìn)行試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)以及數(shù)據(jù)結(jié)果的分析。

1.2.5 GSH含量的測(cè)定

GSH含量的測(cè)定采用DTNB法：利用DTNB和GSH反應(yīng)生成黃色的5-硫代-2-硝基苯甲酸，利用該物質(zhì)在pH8.0時(shí)在412 nm的波長(zhǎng)有最大吸收峰，用分光光度計(jì)測(cè)樣液的吸收值，并對(duì)所測(cè)吸光值做函數(shù)圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。

浸提液中GSH含量的測(cè)定：用0.5 mL GSH浸提液代替GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)上述測(cè)定方法來(lái)測(cè)定乙醇葡萄酒泥谷胱甘肽浸提液的吸光值，利用谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系即可計(jì)算待測(cè)樣品中的谷胱甘肽含量。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

浸提液中GSH的含量用DTNB法來(lái)測(cè)定，利用Origin Pro軟件分析數(shù)據(jù)得到GSH濃度C與吸光值A(chǔ)的回歸方程為A=0.8489C+0.0396（R2=0.0996）。

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 料液比對(duì)酒泥廢酵母GSH提取量的影響

由圖1可知，隨著料液比的比值變大，酒泥廢酵母GSH乙醇提取量開(kāi)始緩慢增加，1∶10 g/mL的料液比時(shí)谷胱甘肽的提取量達(dá)到峰值，隨后提取量開(kāi)始緩慢降低。因?yàn)楫?dāng)乙醇的溶液用量不足或者很少時(shí)，酵母細(xì)胞細(xì)胞壁沒(méi)有充分的被乙醇溶解破碎，導(dǎo)致細(xì)胞的通透性太低使GSH無(wú)法從細(xì)胞中溶解出；GSH本身不穩(wěn)定極易氧化，而乙醇的量過(guò)多會(huì)促進(jìn)GSH氧化，同時(shí)乙醇的添加量變多會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì)胞膜上的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶暴露出來(lái)，將GSH降解[8]，使提取出的GSH在提取過(guò)程中被氧化，導(dǎo)致GSH提取量減少。由此確定料液比的量初步為1∶10 g/mL。

2.2.2 乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)酒泥廢酵母GSH提取量的影響

乙醇作為有機(jī)溶劑能夠增強(qiáng)酵母細(xì)胞的細(xì)胞膜脂類物質(zhì)的流動(dòng)性，可以提高細(xì)胞通透性，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放可以大大的加強(qiáng)。由圖2得到，乙醇的體積分?jǐn)?shù)大于35%時(shí)，GSH的提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加越來(lái)越少，由于GSH是一種易溶于水和低濃度醇，微溶于醇的活性肽[9]，乙醇的體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì)胞的內(nèi)外滲透壓值很大，致使酵母細(xì)胞破裂使大量的其他胞內(nèi)物質(zhì)流出，影響谷胱甘肽的純度，而當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)過(guò)少的時(shí)候，很多谷胱甘肽由于乙醇量過(guò)少無(wú)法提取出來(lái)，致使谷胱甘肽的提取量減少。因此乙醇的體積分?jǐn)?shù)初步確定為35%。

2.2.3 浸提的時(shí)間對(duì)酒泥廢酵母GSH提取量的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%，添加量為10 mL的前提下，設(shè)置不同的浸提時(shí)間來(lái)考察GSH的提取量。由圖3得到在20 min的抽提時(shí)間時(shí)，GSH的提取量較低，浸提時(shí)間為60 min時(shí)達(dá)到峰值，而在當(dāng)時(shí)間達(dá)到100 min，GSH的提取量急劇下降。由于細(xì)胞內(nèi)包括GSH在內(nèi)的多種物質(zhì)容易于細(xì)胞后，胞外溶液濃度提高，胞內(nèi)溶液濃度降低，細(xì)胞內(nèi)外出現(xiàn)了較大的滲透壓差和濃度差，濃度差和滲透壓差使得高濃度一側(cè)的物質(zhì)流向低濃度一側(cè)，導(dǎo)致GSH的提取量很少，35%體積分?jǐn)?shù)的乙醇是稀溶液，為了平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，乙醇溶液不斷的進(jìn)入細(xì)胞，一段時(shí)間后，擴(kuò)散達(dá)到平衡時(shí)，浸提的時(shí)間就不再起作用。所以在40～80 min時(shí)，提取率與時(shí)間呈正相關(guān)，而在時(shí)間超過(guò)80 min后，因?yàn)镚SH的不穩(wěn)定性導(dǎo)致它的提取量下降，另外一個(gè)原因可能是由于GSH是具有強(qiáng)氧化性的物質(zhì)，具有很強(qiáng)不穩(wěn)定性，在空氣中暴露的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致GSH的含量下降[10]。

圖1 料液比對(duì)GSH提取量的影響Figure 1 Effect of ratio of material to liquid on GSH extraction

圖2 乙醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取量的影響Figure 2 Effect of volume fraction of ethanol on extraction

2.2.4 浸提溫度對(duì)酒泥廢酵母GSH提取量的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%，添加量為10 mL，浸提時(shí)間為60 min的前提下，考察了不同浸提溫度對(duì)GSH提取量的影響。由圖4得到，乙醇提取酒泥廢酵母GSH的量隨著浸提的溫度升高呈現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，在50 ℃時(shí)達(dá)到峰值。原因是浸提的溫度對(duì)GSH的穩(wěn)定性有很大的影響，GSH的氧化速度與溫度成負(fù)相關(guān)，高溫條件下會(huì)導(dǎo)致GSH氧化損失從而導(dǎo)致結(jié)果值出現(xiàn)誤差；但如果浸提的溫度過(guò)低，會(huì)使酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜與乙醇的相互作用變?nèi)?，GSH不易從細(xì)胞膜細(xì)胞壁溶出[11]。故乙醇提取酒泥廢酵母的GSH浸提溫度初步確定為50 ℃。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)GSH提取量的影響Figure 3 Effect of extraction time on GSH extraction

圖4 浸提溫度對(duì)GSH提取量的影響Figure 4 Effect of extraction temperature on GSH extraction

2.3 優(yōu)化工藝條件

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)的模型設(shè)計(jì)

以上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，用谷胱甘肽的最終提取率為考察指標(biāo)，有目的選擇出4個(gè)單因素當(dāng)中提取率較高的3個(gè)水平進(jìn)行考察探究，從而更靠近本試驗(yàn)的目的，更有利于最佳提取率的得出。利用Design-Expert V10.0.4 軟件對(duì)谷胱甘肽提取進(jìn)行試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)結(jié)果的分析。得到表1、表2、表3、表4。

表1 響應(yīng)面因素水平及編碼Table 1 Response surface factor level and coding

表2 響應(yīng)面結(jié)果與分析Table 2 Response surface results and analysis

表3 回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Regression equation coefficients and their significance test results

表4 模型驗(yàn)證結(jié)果Table 4 Model verification results

運(yùn)用Design Expert程序?qū)Ρ?的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，分析響應(yīng)值比較顯著的各項(xiàng)單因素，可得料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時(shí)間、浸提溫度與GSH提取量間的二元多項(xiàng)回歸方程：

由表3可以得到，模型回歸顯著（p＜0.0001），可以看出方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的影響都是顯著的，模型的校正決定系數(shù)R2adj為0.9911，說(shuō)明99.11%響應(yīng)值的變化能通過(guò)此模型解釋，可以確定該模型的設(shè)計(jì)值與試驗(yàn)值擬合較好，試驗(yàn)誤差很小。其中影響因素料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞浸提時(shí)間＞浸提溫度。通過(guò)以上數(shù)據(jù)得分得到相應(yīng)的數(shù)據(jù)，該試驗(yàn)可以用于酒泥廢酵母谷胱甘肽的浸提工藝的理論預(yù)測(cè)。

對(duì)得到的回歸方程進(jìn)行方差分析以及顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表4。從表4可知，模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際得到的值吻合的很好，該回歸方程可以用來(lái)確定最佳提取工藝的條件。

2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果圖形分析

根據(jù)回歸方程做出的模型響應(yīng)曲面及其等高線如圖5至圖7所示。

對(duì)任何雙因素交互影響谷胱甘肽提取率的效應(yīng)可通過(guò)圖5、圖6、圖7進(jìn)行分析。得到了影響程度的強(qiáng)弱排序?yàn)椋毫弦罕龋疽掖嫉捏w積分?jǐn)?shù)＞時(shí)間＞溫度，這與模型設(shè)計(jì)得到的方差分析的結(jié)果一致，說(shuō)明了模型的試驗(yàn)結(jié)果具有很強(qiáng)的可靠性。通過(guò)模型得到的回歸方程，利用軟件對(duì)其進(jìn)行求解，以GSH的含量為指標(biāo)，得到谷胱甘肽提取的最佳提取條件為：在料液比1：10.15 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)35.51%、時(shí)間58.39 min、浸提溫度48.90 ℃，能得到最大的谷胱甘肽的提取量為8.8213 mg/g。根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)得到的最優(yōu)條件，對(duì)葡萄酒泥廢酵母浸提，得到谷胱甘肽的提取量為8.8198 mg/g，與理論設(shè)計(jì)得到的值相比較，實(shí)際浸提得到的值與理論值相差很少，說(shuō)明模型設(shè)計(jì)優(yōu)化方案有效。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以葡萄酒泥廢酵母液為原料，以4個(gè)單因素的試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，通過(guò)響應(yīng)面分析法確立了乙醇提取酒泥廢酵母中GSH的最佳提取工藝參數(shù)，并確保了提取谷胱甘肽最優(yōu)工藝參數(shù)的穩(wěn)妥性和可靠性。在料液比為1∶10.15 g/mL、乙醇的體積分?jǐn)?shù)為35.51%、浸提時(shí)間為58.39 min、浸提溫度為48.90 ℃的條件下對(duì)谷胱甘肽進(jìn)行浸提，谷胱甘肽的平均提取率可以達(dá)到8.8213 mg。此研究提高了谷胱甘肽的提取率，對(duì)從葡萄酒酒泥中提取谷胱甘肽提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖5 時(shí)間和溫度等高線圖及交互項(xiàng)因素響應(yīng)面圖Figure 5 Time and temperature contour map and interaction factor response surface diagram

圖6 時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)等高線圖及交互項(xiàng)因素響應(yīng)面圖Figure 6 Time and ethanol volume fraction contour map and interaction factor response surface diagram

圖7 料液比和濃度等高線圖及交互項(xiàng)因素響應(yīng)面圖Figure 7 Material to liquid ratio and concentration contour map and interaction factor response surface diagram