權(quán)明吉，樸正根，滕永旺，許東元，劉蘭，金頭峰

(1 延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000；2 濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院)

胃癌是全球常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，因其發(fā)病率及病死率高而嚴(yán)重影響人們的生命及健康。近年來(lái)隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，胃癌分子靶向治療研究成為了熱點(diǎn)。表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)家族包括HER1(EGFR)、HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)4個(gè)成員，能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移及其他細(xì)胞功能。已有研究發(fā)現(xiàn)，HER2為靶點(diǎn)的靶向治療能延長(zhǎng)胃癌患者的總生存期[1]。Ebp1蛋白是一種最新發(fā)現(xiàn)的ErbB3結(jié)合蛋白，在乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、肝癌等多種腫瘤組織中異常表達(dá)，且Ebp1蛋白表達(dá)與各腫瘤的臨床分期及預(yù)后等有關(guān)[2～5]。有研究表明，胃癌組織中ErbB3較正常胃組織表達(dá)增高，在胃癌中起到重要作用[6]。故Ebp1蛋白作為ErbB3的結(jié)合蛋白，有可能與胃癌有關(guān)。Ki67蛋白是一種增殖細(xì)胞相關(guān)核蛋白，可反映細(xì)胞的增殖狀況，且作為重要的細(xì)胞增殖標(biāo)記物，應(yīng)用于各種腫瘤疾病的研究中。有研究報(bào)道，Ki67蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，且與胃癌的病理特征及預(yù)后相關(guān)[7～9]。但目前Ebp1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)變化及Ebp1和Ki67蛋白在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)胃癌組織及癌旁組織中Ebp1和Ki67蛋白的表達(dá)差異，探討二者的相關(guān)性，為胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究及分子靶向治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集延邊大學(xué)附屬醫(yī)院2011年1月～2013年11月收治的胃癌患者121例，術(shù)中均留取癌組織。患者中男90例，女31例；年齡<60歲37例，≥60歲84例；漢族79例，朝鮮族42例；腫瘤組織高中分化40例，低分化81例；腫瘤直徑<5 cm 71例，≥5 cm 50例；Borrmann分型Ⅰ型+Ⅱ型102例，Ⅲ型+Ⅳ型19例；TNM分期T1～T2期17例，T3～T4期104例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移84例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。術(shù)中另收集60例患者相應(yīng)的癌旁組織作為對(duì)照，男32例，女28例；年齡<60歲26例，≥60歲34例；漢族41例，朝鮮族19例。術(shù)前均未行放、化療，術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)癌組織均為胃腺癌、相應(yīng)癌旁組織均未見(jiàn)累及。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 Ebp1和Ki67蛋白檢測(cè)方法 采用免疫組化SP法。所有樣本離體后經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片；常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；抗原熱修復(fù)，在0.01 mol/L的枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中煮沸10 min，自然冷卻；3% H2O2孵育，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗；血清封閉后，滴加一抗，4 ℃過(guò)夜孵育，PBS沖洗；滴加聚合酶輔助劑，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的多抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，沖洗、復(fù)染、脫水、封片。以試劑盒自帶的陽(yáng)性對(duì)照片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。Ki67蛋白陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕黃色；Ebp1蛋白陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞核呈黃色或棕褐色，細(xì)胞質(zhì)偶可出現(xiàn)著色。隨機(jī)選5個(gè)高倍鏡視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率及染色強(qiáng)度判斷結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞百分率<10%為0分、10%～<25%為1分、25%～<50%為2分、≥50%為3分，染色強(qiáng)度淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。兩項(xiàng)指標(biāo)得分相乘，0為-，1～2為+，3～4為++，5以上為+++。+～+++判為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，胃癌組織與癌旁組織中Ebp1和Ki67蛋白表達(dá)比較行χ2檢驗(yàn)，Spearman等級(jí)相關(guān)分析Ebp1和Ki67蛋白的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ebp1和ki67蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá) 胃癌組織Ebp1和Ki67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為26.45%(32/121)、73.55%(89/121)，均高于癌旁組織的5.00%(3/60)和0(P均<0.05)。

2.2 Ebp1和Ki67蛋白陽(yáng)性表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Ebp1蛋白在Borrmann分型Ⅲ型+Ⅳ型、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于Borrmann分型Ⅰ型+Ⅱ型、高中分化及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P均<0.05)，但Ebp1蛋白表達(dá)在不同性別、年齡、民族患者及腫瘤直徑、TNM分期之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。Ki67蛋白在Borrmann分型Ⅲ型+Ⅳ型、低分化、TNM分期T3～T4期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于Borrmann分型Ⅰ型+Ⅱ型、高中分化、TNM分期T1～T2期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P均<0.05)，但Ki67蛋白表達(dá)在不同性別、年齡、民族患者及腫瘤直徑之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 胃癌組織中Ebp1和ki67蛋白表達(dá)的關(guān)系 胃癌組織中Ebp1蛋白與Ki67蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.34，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 Ebp1和Ki67蛋白陽(yáng)性表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表2 胃癌組織中Ebp1和Ki67蛋白表達(dá)的關(guān)系(例)

3 討論

這些年來(lái)，人們雖然不斷深入研究胃癌的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制，不斷提高胃癌的臨床診斷及治療技術(shù)，但胃癌的發(fā)病率及病死率仍不低。而在中國(guó)，不僅胃癌的發(fā)病率及病死率高，早期胃癌發(fā)現(xiàn)率低，更有胃癌年輕化傾向[10]。所以，一直以來(lái)攻克胃癌是許多臨床醫(yī)師及基礎(chǔ)研究者們的愿望。本研究采用免疫組化SP法檢測(cè)Ebp1蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Ebp1蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織。這與Gannon等[4]在前列腺中及Liu等[3]在宮頸癌中的研究結(jié)果相一致。進(jìn)一步分析Ebp1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Ebp1蛋白在Borrmann分型Ⅲ型+Ⅳ型、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于Borrmann分型Ⅰ型+Ⅱ型、高中分化及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，但Ebp1蛋白表達(dá)在不同性別、年齡、民族患者及腫瘤直徑、TNM分期之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表示Ebp1蛋白在胃癌組織中高表達(dá)，且與胃癌的Borrmann分型、分化程度及淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Ki67蛋白是目前研究者們認(rèn)可的與細(xì)胞增殖相關(guān)的一種細(xì)胞核抗原標(biāo)記物，其功能與有絲分裂有關(guān)。Ki67蛋白在細(xì)胞分裂早期表達(dá)水平較低，而隨著細(xì)胞分裂表達(dá)水平逐漸增高，M期到達(dá)最高值，之后隨著細(xì)胞分裂過(guò)程結(jié)束，表達(dá)水平逐漸下降。Ki67蛋白作為腫瘤增殖標(biāo)記物，應(yīng)用于腫瘤的基礎(chǔ)及臨床研究中[11]。本研究結(jié)果顯示，Ki67蛋白在Borrmann分型Ⅲ型+Ⅳ型、低分化、TNM分期T3～T4期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均高于Borrmann分型Ⅰ型+Ⅱ型、高中分化、TNM分期T1～T2期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，但Ki67蛋白表達(dá)在不同性別、年齡、民族患者及腫瘤直徑之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明Ki67在胃癌中高表達(dá)，且與胃癌的Borrmann分型、分化程度、腫瘤TNM分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。這與劉偉等[8]研究結(jié)果基本一致，且與其他研究[7,9]結(jié)果有相同之處。

我們進(jìn)一步分析了Ebp1和Ki67蛋白之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Ebp1和Ki67蛋白在胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，這與劉蘭等[12]在宮頸癌組織中研究結(jié)果相一致。而Ki67蛋白是常見(jiàn)的腫瘤增殖相關(guān)標(biāo)志物之一，因此我們考慮Ebp1蛋白可能與胃癌細(xì)胞增殖有關(guān)。Kim等[13]報(bào)道，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Ebp1蛋白有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲作用；但與之相反，崔玲玲等[14]認(rèn)為在賁門(mén)癌中Ebp1蛋白有抑制腫瘤增殖作用。究其原因，可能與Ebp1蛋白有兩種亞型p48及p42有關(guān)。有研究者認(rèn)為，p48有致癌作用，能促進(jìn)腫瘤的增殖，而p42可能有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄功能，是一種有效的腫瘤抑制物，抑制腫瘤的增殖[15]。在不同組織中，p48及p42表達(dá)量不同，可能對(duì)腫瘤有著不同的作用，當(dāng)然這有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)Ebp1與Ki67蛋白在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，二者可能有相互促進(jìn)作用；Ebp1和Ki67蛋白表達(dá)陽(yáng)性的患者腫瘤惡性程度更高、侵襲和轉(zhuǎn)移的傾向也更強(qiáng)，因此聯(lián)合檢測(cè)Ebp1及Ki67蛋白有助于判斷胃癌的惡性程度及侵襲、轉(zhuǎn)移能力，且Ebp1蛋白有望成為抑制腫瘤增殖的新靶點(diǎn)。