祁旻龍， 朱 良， Yuri Ciervo， 徐 俊

(1. 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092； 2. 英國謝菲爾德大學(xué)轉(zhuǎn)化神經(jīng)科學(xué)研究所，謝菲爾德S10 2HQ，英國)

皮膚是最大的人體器官，對于保護機體至關(guān)重要，各種因素造成的皮膚損傷難以愈合、愈合速度慢或創(chuàng)傷后發(fā)生瘢痕，給患者帶來極大痛苦。近年來，隨著干細胞技術(shù)的發(fā)展，一種脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose mesenchymal stem cells，ADSCs)因取材方便、免疫原性低等優(yōu)點，用于皮膚損傷的治療而受到越來越多的關(guān)注[2-3]。研究表明，人類ADSCs參與調(diào)節(jié)炎癥過程促進創(chuàng)面愈合，但由于先天缺乏趨化因子受體2(chemokine receptor 2，CCR2)，其靶向性受到影響。本研究通過慢病毒技術(shù)構(gòu)建過表達CCR2的ADSCs，皮下移植入小鼠皮膚創(chuàng)面以觀察其對皮膚創(chuàng)面愈合的影響，為創(chuàng)傷修復(fù)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人皮下脂肪組織樣本由同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，均來自健康成人腹部抽脂手術(shù)脂肪(征得患者及家屬同意并簽署知情同意書)，整個實驗過程均符合同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院倫理委員會要求。質(zhì)粒LV-mCCR2-IRES-ZsGreen1為實驗室自有。雌性ICR小鼠30只，體質(zhì)量25～30g，由同濟大學(xué)實驗動物中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS，美國Hy-clone公司)，抗體CD73、CD105、CD44和CD31(美國BD公司)，ADSCs成脂、骨、軟骨分化試劑盒(加拿大STEMCELL公司)，其他常規(guī)試劑購自同濟大學(xué)后勤物資中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪干細胞的分離和培養(yǎng) 新鮮的脂肪標(biāo)本用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，于無菌操作臺上用無菌剪刀剪碎，加入等體積0.2%膠原酶I，置于37℃的水浴鍋中消化1.5h。加入等體積的培養(yǎng)基終止消化，離心半徑26cm，1500r/min，離心5min。去除上清，用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基將細胞重懸，按106個/mL密度進行接種，記為P0代，即為ADSCs；然后將細胞培養(yǎng)于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中，隔天換液。當(dāng)原代細胞生長至80%～90%時，進行傳代培養(yǎng)，去除培養(yǎng)皿中的上清液，加入PBS連續(xù)漂洗2遍；加入胰蛋白酶0.05%胰蛋白酶/0.5mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)]，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱里消化5min。貼壁細胞懸浮后轉(zhuǎn)入15mL離心管中，離心半徑26cm，1200r/min，離心5min，去除上清液，完全培養(yǎng)基重懸沉淀，以1∶3的比例接種在新的培養(yǎng)皿中，記為P1代。取培養(yǎng)至2～5代的ADSCs進行后續(xù)實驗。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測ADSCs表面標(biāo)記 細胞傳至第3代，首先消化，將細胞盡量吹打成單細胞。按照抗體使用說明書用PBS稀釋抗體，注意避光。將稀釋好的抗體加入到細胞中，輕輕吹打均勻成單細胞懸液，冰上避光孵育30min。孵育完成后，離心半徑26cm，1200r/min，低溫離心10min。去掉上清液，用PBS洗3遍后重懸，過流式細胞儀檢測。

1.2.3 ADSCs成脂、成骨、成軟骨分化及鑒定實驗依誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化方向不同將ADSCs細胞分成三組，即成脂、成骨、成軟骨3組。預(yù)先接種3組ADSCs細胞(104個/cm2)到明膠包被的6孔板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞增殖達80%時，成脂誘導(dǎo)組每孔更換0.5mL成脂分化培養(yǎng)基；成骨誘導(dǎo)組每孔更換0.5mL成骨分化培養(yǎng)基；成軟骨誘導(dǎo)組每孔換成0.2mL成軟骨分化培養(yǎng)基。培養(yǎng)14～21d，每3天換液。誘導(dǎo)結(jié)束之后，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗3遍。向每孔中加入0.5mL的4%多聚甲醛固定30min后用PBS洗3遍。成脂誘導(dǎo)組每孔中加入0.3mL油紅O染液染色30min；成骨誘導(dǎo)組每孔中加入0.3mL茜素紅S染色液染色10min；成軟骨誘導(dǎo)組每孔中加入0.1mL阿利新藍染色液染色30min。其后各組細胞以PBS洗2遍，然后置于倒置顯微鏡下觀察細胞表型變化。

1.2.4 慢病毒構(gòu)建CCR2-增強綠色熒光蛋白(EGFP)-ADSCs和EGFP-ADSCs 復(fù)蘇293T細胞增殖達85%時，將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(過表達組LV-mCCR2-IRES-ZsGreen1，10μg；空載組LV-IRES-ZsGreen1，10μg)、Rev 2μg、VSVG 3μg、pMDL 5μg以1.5mL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋；60μL脂質(zhì)體2000以1.5mL無血清Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，孵育5min后，將上述質(zhì)粒和脂質(zhì)體溶液混合并孵育25min。將孵育后的質(zhì)粒、脂質(zhì)體混和物加入293T細胞，培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h后以含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基全量換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h熒光觀察EGFP表達，48、72h后收集病毒上清，加入聚凝胺至終濃度為8mg/L，感染ADSCs，制備CCR2-EGFP-ADSCs或EGFP-ADSCs，感染12h后換液，48h后鏡下觀察到綠色熒光表達即構(gòu)建成功。

1.2.5 創(chuàng)傷模型制備及分組 將30只ICR小鼠常規(guī)飼養(yǎng)7d后，腹腔注射水合氯醛400mg/kg麻醉，剃去背部毛，在脊背兩側(cè)分別制備0.8cm×0.8cm創(chuàng)面，深至皮下。隨機將小鼠均分為PBS組(注射PBS)、EGFP組(注射EGFP-ADSCs)和CCR2組(注射CCR2-EGFP-ADSCs)，每組10只。

1.2.6 細胞注射及創(chuàng)面觀察 造模隔天在小鼠背部傷口外取4個點，EGFP-ADSCs組和CCR2-EGFP-ADSCs組每個點皮下注射感染的相應(yīng)ADSCs細胞106個，對照組注射等體積PBS。上述實驗后小鼠分籠飼養(yǎng)，每天觀察進食、創(chuàng)面變化及愈合情況，計算創(chuàng)面愈合率，并于造模后第9天分別切取各組移植區(qū)的全層皮膚1cm×1cm制作組織石蠟切片，H-E染色鏡下觀察創(chuàng)傷愈合情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs的分離和培養(yǎng)

分離消化得到的原代細胞的接種到培養(yǎng)皿中，貼壁后細胞體細長，以渦旋式的方式擴增，傳至3～4代時細胞形態(tài)均一，呈梭形的成纖維細胞樣，見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察脂肪間充質(zhì)干細胞梭形細胞樣Fig.1 Fibroblast-like ADSCs, inverted microscope (×10)

2.2 流式細胞儀鑒定ADSCs表型

細胞傳至第3代，流式分析結(jié)果表明細胞高表達ADSCs表面抗原如CD44(95.0%)、CD73(99.5%)和CD105(98.0%)，基本不表達CD31，流式術(shù)細胞結(jié)果如圖2。

圖2 流式細胞技術(shù)檢測脂肪間充質(zhì)干細胞表面抗原CD44、CD31和CD73、CD105Fig.2 By using flow cytometry technique to identify immune phenotype of ADSCs,CD44&CD31 CD73&CD105A: 細胞高表達ADSCs表面抗原CD44(95.0%)、基本不表達CD31；B: 細胞高表達ADSCs表面抗原CD105(98.0%)，CD73(99.5%)

2.3 ADSCSs成脂、成骨、成軟骨分化及鑒定

ADSCs成脂肪誘導(dǎo)14d后鏡下細胞可見明顯脂滴，經(jīng)油紅O染色脂滴呈紅色，見圖3A；成骨誘導(dǎo)21d發(fā)現(xiàn)明顯的礦物質(zhì)沉積，茜素紅S染色后可見深紅色礦化結(jié)節(jié)，見圖3B；成軟骨誘導(dǎo)14d經(jīng)阿利新藍染色可見呈藍色的軟骨細胞，見圖3C。

圖3 ADSCs成脂、成骨和成軟骨體外誘導(dǎo)分化(×100)Fig.3 Adipogenic,osteogenic and chondrogenicdifferentiation of ADSCs(×100)A: 成脂誘導(dǎo)后ADSCSs呈紅色(油紅O染色);B: 成骨誘導(dǎo)后ADSCSs呈深紅色(茜素紅S染色);C: 成軟骨誘導(dǎo)后ADSCSs呈藍色(阿利新藍染色)

2.4 慢病毒構(gòu)建CCR2-EGFP-ADSCs和EGFP-ADSCs

慢病毒感染ADSCs后，于48h時在熒光顯微鏡下，EGFP-ADSCs組和CCR2-EGFP-ADSCs組均可觀察到EGFP表達，至72h時，熒光表達較強，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可達70%，見圖4。

圖4 ADSCs感染72h后鏡下觀察熒光(×10)Fig.4 Expression of EGFP in ADSCs at 72 hours after transfection(×10)圖中可見轉(zhuǎn)染72h時，圖A圖B熒光表達均較強，細胞形態(tài)呈梭形，與正常細胞形態(tài)并無差別

2.5 皮膚愈合情況檢查

皮膚創(chuàng)傷造模及細胞移植后各組小鼠均存活，體征均正常。造模后每天測量并記錄創(chuàng)面愈合情況，可見CCR2-EGFP-ADSCs組傷口愈合相較于另外兩組明顯變快，見圖5。CCR2-EGFP-ADSCs組、EGFP-ADSCs組和對照組第5、9天的創(chuàng)面愈合率分別為(68±3.1)%和(91±2.1)%、(63±2.7)%和(87±2.1)%、(58±3.5)%和(80±2.9)%。結(jié)果顯示注射了ADSC的兩組愈合速度顯著好于PBS對照組(P<0.05)。CCR2-EGFP-ADSCs組愈合速度顯著好于EGFP-ADSCs組(P<0.05)。

圖5 ADSCs移植對小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的作用Fig.5 Wound healing effects of ADSCs transplantation圖中顯示3組小鼠與造模后創(chuàng)面愈合情況，可見初始傷口面積均一，隨著時間推移，注射了ADSC的兩組傷口收縮速度，即愈合速度顯著好于PBS對照組(P<0.05)；CCR2-EGFP-ADSCs組愈合速度顯著好于EGFP-ADSCs治療組(P<0.05)

2.6 皮膚組織H-E染色結(jié)果

術(shù)后第9天，鏡下可見相對于正常皮膚組織，對照組、EGFP-ADSCs組和EGFP-CCR2-ADSCs組新增上皮生長活躍，有增生的血管腔，大小不一，真皮層厚度均有增加，但3組間厚度無顯著性差異。相比對照組，EGFP-CCR2-ADSCs組和EGFP-ADSCs組皮膚真皮層中存在較明顯的類似于正常皮膚的毛囊結(jié)構(gòu)，且EGFP-CCR2-ADSCs組較EGFP-ADSCs組更密集，可見多個橢圓形尚未成熟的毛囊結(jié)構(gòu)，見圖6。

表1各組小鼠不同時間點皮膚創(chuàng)面愈合率比較

Tab.1 Comparison of wound healing ratio in different groups

圖6 各組小鼠皮膚組織H-E染色結(jié)果Fig.6 H-E staining results of skin tissue(×200)A： 正常皮膚組織;B： 對照組(注射PBS);C: EGFP-ADSCs組;D: EGFP-CCR2-ADSCs新增上皮情況;圖B、C、D顯示皮膚組織均生長活躍，有增生的血管腔，大小不一，真皮層厚度均有增加，但3組間厚度無顯著性差異；圖C、D顯示存在較明顯的類似于正常皮膚的毛囊結(jié)構(gòu),紅色箭頭所示

3 討 論

皮膚是最大的人體器官，機械外傷、組織切除手術(shù)和疾病(如糖尿病足)等多種原因均會造成皮膚創(chuàng)傷。近來，隨著干細胞應(yīng)用研究的不斷深入，越來越多的臨床前和臨床研究證明了干細胞移植對于皮膚損傷修復(fù)的治療效果[6-7]。在眾多類型干細胞中，來源于中胚層的ADSCs具有多方向分化潛能，因獲取途徑廣泛，獲取代價小，不涉及倫理問題等優(yōu)勢，成為干細胞治療優(yōu)選[8-10]。本研究通過流式細胞分選檢測脂肪組織分離獲得的原代細胞，發(fā)現(xiàn)其高表達ADSCSs表面抗原如CD44(95%)、CD73(99.5%)和CD105(98%)，基本不表達CD31，并且在特定的分化培養(yǎng)液中分化為骨、軟骨、脂肪樣細胞群，驗證了ADSCs的多向分化潛能。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)情況下，移植的ADSCs在體內(nèi)往往是短暫存在的，對于損傷發(fā)生部位的靶向性較差[11]，其可能的原因涉及幾種重要的細胞運輸相關(guān)分子，如趨化因子和趨化因子受體[12]。在皮膚損傷修復(fù)炎性反應(yīng)階段，損傷部位分泌大量趨化因子，趨化因子通過其受體招募多種細胞參與損傷修復(fù)(如調(diào)控白細胞黏附、外移、歸巢)，趨化因子受體是一類介導(dǎo)行使功能的GTP-蛋白偶聯(lián)的跨膜受體(GPCR)，通常表達于免疫細胞、內(nèi)皮細胞等胞膜上，能夠與趨化因子特異性結(jié)合從而誘導(dǎo)免疫細胞至感染和炎癥部位[13]。CCR2是重要的趨化因子受體，能通過和多種趨化因子(MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5)結(jié)合，廣泛參與細胞的招募和介導(dǎo)[14-15]。相關(guān)研究表明在人ADSCs中缺乏炎癥趨化因子受體CCR2?；贑CR2能增強細胞的遷移和聚集、加快組織修復(fù)過程的特點，本研究在人ADSCs中利用慢病毒感染法過表達CCR2，加強細胞炎癥趨化能力，研究其是否能更加有效地促進皮膚創(chuàng)傷的愈合。本實驗在小鼠背部制造0.8cm×0.8cm皮膚全皮層切除創(chuàng)面，模擬皮膚損傷，于造模第2天分別皮下注射CCR2-EGFP-ADSCs、EGFP-ADSCs和PBS。皮膚創(chuàng)傷造模及細胞移植后各組小鼠均存活，活動自如，各項體征均正常，未見血尿和血便。對比造模后0～9d傷口愈合情況，可見移植了ADSCs的兩組小鼠傷口在注射細胞后愈合速度均高于注射PBS的對照組(P<0.05)；CCR2-EGFP-ADSCs組愈合速度最快，高于EGFP-ADSCs組(P<0.05)。移植了ADSCs的兩組新生皮膚真皮層中存在較明顯的類似于正常皮膚的毛囊結(jié)構(gòu)，對照組中未發(fā)現(xiàn)此結(jié)構(gòu)，并且EGFP-CCR2-ADSC組較EGFP-ADSC組更密集，可見多個橢圓形尚未成熟的毛囊結(jié)構(gòu)，提示過表達CCR2的ADSCs在一定程度上促進創(chuàng)傷修復(fù)再上皮化。

綜上所述，本研究通過慢病毒感染構(gòu)建過表達CCR2的ADSCs，移植到創(chuàng)傷模型小鼠的創(chuàng)面四周，與常規(guī)的ADSCs治療法和注射PBS的對照組進行比較，可見愈合速度顯著加快，并有促進上皮化趨勢，初步證實了過表達CCR2促進ADSCs對皮膚損傷的修復(fù)，但其具體分子機制尚需進一步深入研究。