付凌云， 楊 紅，林 丹，黃妮雯，徐旖旎，陶 玲，沈祥春

(貴州醫(yī)科大學藥學院 1. 天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室、2. 藥用植物功效與利用國家重點實驗室、3. 貴州省普通高等學校天然藥物藥理與成藥性評價重點實驗室、4. 貴州省特色天然藥物資源高效利用工程中心，貴州 貴陽 550025)

國內外研究表明，心血管疾病(cardiovascular diseases，CVDs)的高發(fā)病率和高死亡率已經嚴重威脅到人們的身心健康，預計到2020年，將成為世界首要致死原因[1]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是CVDs的主要風險因素，以血管內膜形成纖維斑塊為特征，主要累及大動脈和中動脈，使動脈壁變硬，管腔狹窄，中膜彈性減弱。已經證實AS是一種慢性炎癥疾病，炎癥是AS早期階段的關鍵事件，貫穿AS病理過程的始終[2]。

AS斑塊破裂是促進AS發(fā)展的一個重要原因，炎癥誘導內皮細胞的血管新生是AS斑塊由穩(wěn)定轉換為不穩(wěn)定的首要因素[3]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最關鍵的血管新生促進因子，在血管新生的過程中，它通過和自身的特異性受體結合而發(fā)揮生物活性。VEGF受體-2(VEGFR-2)是VEGF發(fā)揮生物活性最關鍵的受體，故VEGFR-2的表達在血管新生相關信號通路中具有重要的作用[4]。研究表明，在心血管系統(tǒng)中，血管內皮細胞是炎性細胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)重要的作用靶點，它能夠誘導內皮細胞VEGFR-2分泌增加，促進血管新生，且該過程受到細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的調控[5]。

貴州地產民族藥艷山姜為姜科山姜屬植物艷山姜Alpiniazerumbet(Pers.) Burttet Smith的干燥成熟果實，具有溫中燥濕、行氣止痛、截瘧之功效[6]。研究表明，艷山姜的主要活性成分艷山姜揮發(fā)油(essential oil of FructusAlpiniaezerumbet，EOFAZ)具有廣泛的抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、防治心血管系統(tǒng)疾病等多方面的生物活性[7-9]。目前，國內只有本實驗室在對EOFAZ進行相關實驗研究，但EOFAZ對TNF-α誘導的血管新生及炎性損傷的作用及機制還未明確。因此，本研究主要探討EOFAZ對TNF-α誘導的血管新生及炎性損傷的作用及機制，旨在為EOFAZ在預防和治療CVDs方面提供新的治療策略。

1 材料

1.1EOFAZ的提取和配制艷山姜的果實采集于貴州省貞豐縣，經貴州醫(yī)科大學藥學院生藥學與藥用植物學教研室龍慶德教授鑒定為姜科山姜屬植物Alpiniazerumbet(Pers.) Burttet Smith 的干燥成熟果實。水蒸氣蒸餾法提取，無水硫酸鈉除水后，于4 ℃長期保存。取50 μL(約為44.5 mg)EOFAZ于10 mL的EP管中，加入4 400 μL的二甲基亞砜完全溶解，即可得到濃度為1×107μg·L-1的EOFAZ母液，用1.5 mL的棕色EP管分裝于4 ℃冰箱保存。臨用時，用無血清培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。DMSO的終濃度不超過0.1%。

1.2實驗動物與細胞昆明種♂小鼠，4～6周齡，體質量(20 ± 2)g，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK(黔2018-0001)，使用許可證號：SYXK(黔2018-0001)。人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購自美國ScienCell公司(批號：8000)。

1.3試劑內皮細胞培養(yǎng)基購自美國ScienCell公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；重組人/鼠TNF-α購自Peprotech公司；阿司匹林標準品購自中國食品檢定研究所(批號：100113-201405)；U0126購自Gene Operation Datasheet公司(批號：IMA1001-OO25MG)；VEGFR-2抗體和GAPDH抗體購自Proteintech公司；VEGFR-2和GAPDH引物購自貴陽金工科技有限公司；小鼠VEGFR-2酶聯(lián)免疫分析試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.4儀器3020-426多功能全波長酶標儀(Thermo公司)；CFX型凝膠成像系統(tǒng)、Universal Hood Ⅱ型實時熒光定量PCR系統(tǒng)儀(Bio-Rad公司)；XDS-2B倒置顯微鏡(日本尼康公司)。

2 方法

2.1動物模型的制備與分組60只昆明種小鼠按體質量隨機分為5組：對照組、模型組(TNF-α 100 μg·kg-1)、單獨EOFAZ組(0.18 g·kg-1)、EOFAZ組(TNF-α+EOFAZ 0.18 g·kg-1)、阿司匹林組(TNF-α+阿司匹林200 mg·kg-1)，每組12只。對照組和模型組每日灌胃生理鹽水1次，單獨EOFAZ組和EOFAZ組每日灌胃EOFAZ 1次，陽性藥組每日灌胃阿司匹林1次，各組連續(xù)給藥7 d。各組末次給藥2 h后，除對照組和單獨EOFAZ組外，其余各組腹腔注射TNF-α建立小鼠急性炎癥損傷模型。干預24 h后，頸動脈插管取血，室溫3 500 r·min-1離心10 min收集血清，用于VEGFR-2酶聯(lián)免疫分析實驗，分離小鼠胸主動脈用于HE染色實驗。

2.2細胞培養(yǎng)與分組用含有5%胎牛血清、1%內皮細胞生長因子、1%青霉素/鏈霉素的內皮細胞培養(yǎng)基，將HUVECs接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2和95%濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據細胞生長情況進行細胞換液和常規(guī)傳代培養(yǎng)，實驗所用細胞均為3～6代。選取生長良好的細胞，經無血清培養(yǎng)基同步化6 h后，先用EOFAZ、阿司匹林或U0126預處理1 h，再用TNF-α誘導24 h。實驗分為對照組、模型組(TNF-α 20 μg·L-1)、EOFAZ不同劑量組(TNF-α+EOFAZ 0.25、0.5、1.0 μg·L-1)、陽性藥組(TNF-α+阿司匹林0.25 mmol·L-1)、ERK抑制劑組(TNF-α+U0126 10 μmol·L-1)、EOFAZ不同劑量組與ERK抑制劑聯(lián)用組(TNF-α+EOFAZ 0.25、1.0 μg·L-1+U0126 10 μmol·L-1)。

2.3檢測指標

2.3.1 HUVECs血管新生檢測 細胞按“2.2”分組給藥處理后，胰蛋白酶消化法制備成細胞懸液，以4×108·L-1的密度將細胞接種于包被了冷凍的基底膜基質(10 g·L-1)的24孔板中。將細胞培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱，在37 ℃、5% CO2的條件下孵育6 h，小心將孔中培養(yǎng)基吸去，加入PBS洗3次，倒置顯微鏡采集照片，對小管成環(huán)數量進行統(tǒng)計。實驗獨立重復5次。

2.3.2 Western blot檢測HUVECs中VEGFR-2蛋白表達 經藥物干預后，每瓶細胞中加入適當的裂解液提取蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定濃度。將25 μg的蛋白在10% SDS-PAGE中電泳，轉膜，封閉，加入一抗(VEGFR-2為1 ∶1 000，GAPDH為1 ∶10 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后，二抗(1 ∶7 000)孵育1 h。再次洗膜后，ECL化學發(fā)光試劑盒顯色，然后將膜置于凝膠成像系統(tǒng)曝光，隨后用Image-Lab軟件對數字圖像進行量化。實驗獨立重復3次。

2.3.3 Real-time PCR檢測HUVECs中VEGFR-2 mRNA表達 經藥物干預后，根據試劑盒說明書提取總RNA，然后將提取的RNA進行反轉錄合成cDNA，最后按照兩步法PCR擴增標準程序95 ℃、30 s進行預變性，95 ℃、5 s和62.5 ℃、30 s進行30個循環(huán)的擴增，檢測VEGFR-2的基因表達。以GAPDH為內參基因，采用CFX-Manager軟件進行統(tǒng)計。引物序列見Tab 1，實驗獨立重復3次。

2.3.4 小鼠胸主動脈HE染色分析 小鼠胸主動脈分離后，于10%中性福爾馬林中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片后HE染色，光學正置顯微鏡下采集照片。

2.3.5 ELISA法檢測小鼠血清VEGFR-2水平 將經過藥物干預的小鼠血清收集之后，根據試劑盒說明書操作。

Tab 1 Primer sequences of VEGFR-2 and GAPDH

3 結果

3.1EOFAZ和U0126對TNF-α誘導HUVECs中血管新生的影響病理性的血管新生是促進AS斑塊不穩(wěn)定的主要原因，ERK信號通路在血管新生中具有重要的調控作用[8]。通過體外血管新生實驗，檢測EOFAZ和ERK抑制劑U0126對TNF-α誘導HUVECs血管新生的影響。如Fig 1所示，與對照組相比，TNF-α干預細胞后，HUVECs血管新生小管成環(huán)數量明顯增加，而給予EOFAZ和U0126預處理后，能明顯抑制TNF-α誘導HUVECs血管新生小管成環(huán)的數量(P<0.01)。

3.2EOFAZ下調TNF-α誘導HUVECs中VEGFR-2的蛋白表達VEGFR-2是血管新生中一個重要的調控分子[10]。如Fig 2所示，與對照組相比，TNF-α能夠上調HUVECs中VEGFR-2的蛋白表達，而EOFAZ預處理能明顯抑制TNF-α誘導HUVECs中VEGFR-2的蛋白表達。

3.3EOFAZ下調TNF-α誘導小鼠血清中VEGFR-2的水平動物實驗進一步分析EOFAZ對TNF-α誘導小鼠血清中VEGFR-2分泌水平的影響。如Fig 3所示，與對照組相比，單獨給予EOFAZ時，對VEGFR-2的分泌水平沒有影響，差異無顯著性。提示EOFAZ本身對小鼠VEGFR-2的分泌水平沒有影響。而TNF-α干預后，小鼠血清中VEGFR-2的水平明顯升高，EOFAZ預處理能下調TNF-α誘導小鼠血清中VEGFR-2的水平，差異具有顯著性(P<0.05)。以上結果提示，EOFAZ可能通過下調VEGFR-2的表達，抑制TNF-α誘導HUVECs血管新生。

3.4EOFAZ通過VEGFR-2-ERK信號通路抑制TNF-α誘導的HUVECs血管新生研究表明，VEGFR-2-ERK信號通路在血管新生中具有極為重要的作用[4]，為了進一步研究EOFAZ抑制TNF-α誘導HUVECs血管新生的作用機制，采用EOFAZ和ERK抑制劑U0126聯(lián)用處理HUVECs。如Fig 4所示，與TNF-α組相比，ERK抑制劑U0126能明顯抑制TNF-α誘導HUVECs中VEGFR-2蛋白和mRNA的表達，提示ERK信號通路能夠調控VEGFR-2的表達。

Fig 1 EOFAZ and U0126 inhibited number of tube formation in TNF-α-induced HUVECs n=5)

A: The tube formation figures (×50). a: Control group; b: TNF-α group (20 μg·L-1); c: EOFAZ group (1.0 μg·L-1); d: EOFAZ group (0.5 μg·L-1); e: EOFAZ group (0.25 μg·L-1); f: Aspirin group (0.25 mmol·L-1); g:U0126 group (10 μmol·L-1) ; B: The tube formation statistical figure.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTNF-α group.

Fig 2 EOFAZ inhibited protein expression of VEGFR-2 in TNF-α-induced HUVECs n=3)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsTNF-α group

Fig 3 EOFAZ down-regulated expression of VEGFR-2 in serum of TNF-α-induced mice n=12)

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsTNF-α group

單獨的U0126干預組和EOFAZ與U0126聯(lián)用干預組都能抑制VEGFR-2蛋白和mRNA表達，但差異無顯著性，提示EOFAZ可能是通過ERK通路，下調VEGFR-2的表達。

3.5EOFAZ抑制TNF-α誘導小鼠胸主動脈中炎性細胞浸潤動物實驗研究EOFAZ對TNF-α誘導小鼠胸主動脈炎性損傷的作用。如Fig 5所示，對照組中小鼠胸主動脈外膜、中膜及內膜均未見炎性細胞浸潤；TNF-α干預后，可見小鼠胸主動脈外膜和中膜有明顯的炎性細胞浸潤(圖中紅色箭頭所指處)，而給予EOFAZ預處理可明顯抑制小鼠胸主動脈中炎性細胞的浸潤。

Fig 4 Combination of EOFAZ and U0126 down-regulated protein and mRNA expressions of VEGFR-2 in TNF-α-induced HUVECs

A: The protein expression of VEGFR-2; B: The mRNA expression of VEGFR-2.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsTNF-α group.

4 討論

血管新生是AS重要的病理學特征，在AS易損斑塊中發(fā)現(xiàn)有大量的血管新生，血管新生對維持AS斑塊的穩(wěn)定性具有重要的作用[10]。VEGFR-2是VEGF的高親和性受體，是調控血管新生的重要分子。正常的血管內皮細胞中，VEGFR-2也有表達，本研究通過體外培養(yǎng)HUVECs，采用血管新生實驗，觀察TNF-α對HUVECs血管新生的影響，并應用EOFAZ對上述過程進行干預。

Fig5EOFAZinhibitedinflammatorycellsinfiltrationinthoracicaortaofTNF-α-inducedmice(×400)

A: Control group; B: TNF- α group (100 μg·kg-1); C: EOFAZ group (0.18 g·kg-1); D: EOFAZ 0.18 g·kg-1+ TNF-α 100 μg·kg-1; E: Aspirin 200 mg·kg-1+ TNF-α 100 μg·kg-1.當細胞受到TNF-α等炎性細胞因子刺激時，會使細胞內VEGFR-2的表達上調，參與內皮細胞增殖，促進內皮細胞血管新生，加快AS進程[11-12]。因此，抑制炎性細胞因子誘導的內皮細胞血管新生，已經成為延緩AS斑塊破裂的重要治療靶點。

研究結果發(fā)現(xiàn)，TNF-α能夠誘導HUVECs大量血管新生，可見小管成環(huán)數量明顯增多，而EOFAZ干預后，HUVECs小管成環(huán)數量明顯降低。同時，Western blot和動物實驗發(fā)現(xiàn)，TNF-α能夠上調HUVECs中VEGFR-2的蛋白表達及小鼠血清中VEGFR-2的水平，EOFAZ干預后，能夠明顯下調HUVECs中VEGFR-2的蛋白表達及小鼠血清中VEGFR-2的水平。提示EOFAZ對TNF-α誘導HUVECs血管新生的抑制作用可能與下調VEGFR-2表達有關。

ERK是絲裂原激活蛋白激酶家族中的主要成員之一，主要參與細胞的增殖過程。研究表明，TNF-α等炎性細胞因子刺激，能夠激活內皮細胞中的ERK信號，從而對內皮細胞血管新生及VEGFR-2的表達進行調控[13]。我們采用ERK抑制劑U0126對細胞進行干預，進一步研究EOFAZ抑制TNF-α誘導HUVECs血管新生及VEGFR-2表達的作用機制。結果發(fā)現(xiàn)，U0126能夠明顯抑制HUVECs血管新生小管成環(huán)數量及VEGFR-2的表達。更重要的是，在Western blot和qRT-PCR實驗中，單獨U0126干預組和U0126與EOFAZ聯(lián)用干預組都能夠明顯抑制TNF-α誘導HUVECs中VEGFR-2蛋白和mRNA的表達，但差異無顯著性，提示EOFAZ下調TNF-α誘導HUVECs中 VEGFR-2的表達可能與ERK信號通路有關。

本研究還通過TNF-α干預小鼠，觀察EOFAZ對TNF-α誘導小鼠炎性損傷的影響。結果表明，TNF-α干預后，增加了小鼠胸主動脈外膜和中膜炎性細胞的浸潤，說明我們建立的炎性損傷模型是成功的。而給予EOFAZ干預后，能夠明顯抑制炎性細胞的浸潤，提示EOFAZ能夠抑制TNF-α誘導的小鼠炎性損傷。

綜上所述，EOFAZ能夠抑制TNF-α誘導的HUVECs中血管新生及小鼠炎性損傷，其機制可能與通過ERK信號通路抑制VEGFR-2的表達有關。

(致謝：本實驗于貴州醫(yī)科大學天然藥物優(yōu)效利用重點實驗室完成，感謝實驗室各位老師的悉心指導以及同學的幫助！)