葉芳杏，何俊慧，李梅蘭，黃仁彬，謝佳秀，黃建春

( 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021)

高血壓、冠心病、心肌梗死等多種心血管疾病是導(dǎo)致慢性心衰最常見(jiàn)、最重要的高危因素之一，其發(fā)病人數(shù)及發(fā)病率逐年上升[1]。各種病理性因素刺激引發(fā)的心室重構(gòu)是導(dǎo)致心衰的內(nèi)在原因。研究發(fā)現(xiàn)，若能去除這些因素的刺激，心室重構(gòu)是一個(gè)可逆的病理生理過(guò)程[2]。玉郎傘(又稱龍眼參)系蝶形花科植物疏葉崖豆Millettiapulchra(Benth.) Kurz var. Laxior (Dunn) Z.Wei 的塊根，已被收錄于地方民族藥志《廣西自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(2008年版)》。為了進(jìn)一步明確玉郎傘治療心血管疾病的藥效學(xué)基礎(chǔ)，我們對(duì)玉郎傘進(jìn)行了一系列化學(xué)成分提取、分離，獲得了多個(gè)單體[3]。其中，藥效篩選實(shí)驗(yàn)表明，17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮(17-methoxyl-7-hydroxy-benzene-furanchalcone, MHBFC)活性較強(qiáng)。前期研究發(fā)現(xiàn)，MHBFC能明顯恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的分泌功能，提高心肌組織內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)活性，增加NO釋放，能明顯逆轉(zhuǎn)大鼠壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心血管重構(gòu)[4]。而eNOS活性是如何被調(diào)控的，其機(jī)制尚未清楚。因此，本研究在前期工作基礎(chǔ)上，復(fù)制大鼠壓力超負(fù)荷心室重構(gòu)模型，造模給藥后，分離提取心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(myocardial microvascular endothelial cell, MMVEC)，探討MHBFC預(yù)處理對(duì)壓力超負(fù)荷心室重構(gòu)大鼠MMVEC eNOS-NO信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，以期了解MHBFC預(yù)處理逆轉(zhuǎn)壓力超負(fù)荷心室重構(gòu)大鼠的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步明確MHBFC的作用靶點(diǎn)，對(duì)于有效控制壓力超負(fù)荷心室重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展具有重要的理論意義。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，♂，體質(zhì)量(140±20)g，廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)及使用許可證號(hào)分別為SCXK桂2014-0002、SYXK桂2014-0003。

1.2藥物與試劑玉郎傘采自廣西靈山，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為蝶形花科植物疏葉崖豆的塊根；玉郎傘黃酮單體MHBFC，由廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提取分離，經(jīng)HPLC檢測(cè)純度為95%；亞硝基左旋精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride,L-NAME)(Sigma，批號(hào)BCBF4375V)；戊巴比妥鈉(Merck，批號(hào)P11011)；Ⅱ型膠原酶(Gibco，批號(hào)1212804)；0.25%胰蛋白酶(Gibco，批號(hào)1830857)；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium, ECM)(ScienCell，批號(hào)21959)；Dil-乙酰低密度脂蛋白(Dil-acetylated low-density lipoprotein, Dil-Ac-LDL)(Solarbio，批號(hào)20170414)；增強(qiáng)型RIPA裂解液(博士德生物工程有限公司，批號(hào)11K18B02)；Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Beyotime Biotechnology，批號(hào)060216160810)；兔抗鼠eNOS、p-eNOS、Akt、p-Akt單克隆抗體、紅外熒光染料標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(美國(guó)CST公司)；兔抗鼠PI3K p85、p-PI3K p85 Tyr607單克隆抗體(OriGene Technologies公司)；PCR引物及試劑盒(TaKaRa公司)。

1.3儀器BB-150細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)；CKX-41熒光倒置顯微鏡(奧林巴斯有限公司)；ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司)。

2 方法

2.1動(dòng)物造模、分組及給藥按照文獻(xiàn)[4]縮窄大鼠腹主動(dòng)脈，誘導(dǎo)心室重構(gòu)模型。假手術(shù)組大鼠只游離腹主動(dòng)脈，不縮窄。術(shù)后d 4，將存活大鼠隨機(jī)分為 6組，每組5只：① 假手術(shù)組；② 模型組；③ MHBFC 6 mg·kg-1組；④ MHBFC 12 mg·kg-1組；⑤ MHBFC 12 mg·kg-1+L-NAME 50 mg·kg-1組；⑥L-NAME 50 mg·kg-1組。分組后灌胃給予相應(yīng)藥物，各組藥物用蒸餾水溶解配制成相應(yīng)濃度，連續(xù)給藥42 d，每天灌胃1次。

2.2MMVEC分離培養(yǎng)及鑒定參照文獻(xiàn)[5]酶消化法并加以適當(dāng)改進(jìn)。麻醉大鼠后，75%酒精消毒2 min，取心臟，Hanks液洗3遍，剪取左心室，75%酒精滅活心內(nèi)外膜組織15 s，將心肌組織剪成約1 mm3大小的組織塊，把組織塊夾到15 mL離心管，分別滴加0.2%Ⅱ型膠原酶5 mL和0.25%胰蛋白酶6 mL，各消化10 min，消化結(jié)束后，滴加內(nèi)含5%胎牛血清、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和1%青霉素/鏈霉素的ECM終止消化，200目金屬篩網(wǎng)過(guò)濾，1 200 r·min-1離心8 min，棄上清，用2 mL ECM反復(fù)吹打，直到混成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶再加入2 mL ECM，輕輕搖晃，使細(xì)胞分散，放到37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，倒出培養(yǎng)液，滴加ECM繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3 d換液1次，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。采用Dil-Ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)鑒定MMVEC，鑒定方法參照文獻(xiàn)[6]。

2.3qPCR檢測(cè)MMVECeNOS、PI3K、Akt基因表達(dá)目的基因eNOS、PI3K、Akt及內(nèi)參GAPDH引物序列見(jiàn)Tab 1。用Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR system 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用公式2-ΔΔCt計(jì)算MMVEC各基因相對(duì)表達(dá)量。

Tab 1 Primer sequences of qPCR

2.4Westernblot檢測(cè)MMVECeNOS、p-eNOS、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表達(dá)當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿90%時(shí)，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)基，每瓶MMVEC中加入500 μL配好的混合液(每1 mL冷的蛋白裂解液加入10 μL增強(qiáng)型RIPA裂解液和10 μL磷酸酶抑制劑)，裂解，提取MMVEC蛋白，蛋白定量后煮沸，SDS-PAGE恒壓電泳分離蛋白質(zhì)后，轉(zhuǎn)印蛋白于PVDF膜，封閉液搖床1 h，將膜分別放入裝有相應(yīng)比例稀釋的一抗中，4 ℃孵育14～24 h，洗膜后，將膜放入二抗稀釋液稀釋的紅外熒光染料標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗中(1 ∶15 000)，搖床上室溫避光孵育1 h。采用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃膜，保存圖片。用Odyssey掃膜軟件分析各條帶的灰度值，結(jié)果以目的條帶和內(nèi)參條帶的灰度值比值來(lái)表示該蛋白的表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1MMVEC的形態(tài)學(xué)觀察取部分原代培養(yǎng)d 3的細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，細(xì)胞大部分已貼壁，體積較小，多數(shù)呈短梭狀，少數(shù)呈多角形或三角形，散在單層排列(Fig 1A)。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，大部分細(xì)胞已完全伸展開(kāi)，體積變大，呈梭形、三角形或多角形。培養(yǎng)至d 5，貼壁細(xì)胞較多，幾乎長(zhǎng)滿瓶底，呈現(xiàn)典型內(nèi)皮細(xì)胞的鋪路石樣結(jié)構(gòu)(Fig 1B)。

3.2MMVEC鑒定取培養(yǎng)至d 5的原代細(xì)胞，采用Dil-Ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)鑒定。細(xì)胞經(jīng)Dil-Ac-LDL染色后，于熒光倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，其陽(yáng)性表達(dá)率> 95%(Fig 2)，說(shuō)明該細(xì)胞為MMVEC。陰性對(duì)照細(xì)胞不能觀察到熒光。

Fig 1 MMVEC morphology(×200) A: Cultured for 3 d; B: Cultured for 5 d.

Fig 2 Dil-Ac-LDL dyed picture of MMVEC (×200)

3.3MHBFC對(duì)壓力超負(fù)荷心室重構(gòu)大鼠MMVECeNOS、PI3K、Akt基因表達(dá)水平的影響如Tab 2所示，縮窄腹主動(dòng)脈6周后，模型組和L-NAME組大鼠MMVEC eNOS、PI3K、Akt mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)；L-NAME組大鼠MMVEC eNOS mRNA表達(dá)比模型組下調(diào)更明顯(P<0.05)，但合用MHBFC后，被抑制的eNOS、PI3K、Akt mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；另外，MHBFC預(yù)處理組eNOS、PI3K、Akt mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。

Tab 2 Effect of MHBFC on expression of eNOS, PI3K and Akt genes in MMVEC of rats with pressure overload-induced ventricular remodeling n=5)

#P<0.05vssham-operated;*P<0.05vsmodel;△P<0.05vsL-NAME 50 mg·kg-1

3.4MHBFC對(duì)壓力超負(fù)荷心室重構(gòu)大鼠MMVECp-eNOS、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)的影響如Fig 3、Tab 3所示，縮窄腹主動(dòng)脈6周后，模型組和L-NAME組大鼠MMVEC p-eNOS、p-PI3K和p-Akt 蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)，總eNOS、PI3K和Akt蛋白表達(dá)水平也下調(diào)，但各組間總的eNOS、PI3K和Akt蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。合用MHBFC后，被抑制的MMVEC p-eNOS、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；另外，MHBFC預(yù)處理組MMVEC p-eNOS、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。

Fig 3 Representative Western blot bands of p-eNOS, eNOS, p-Akt, Akt, p-PI3K, PI3K and GAPDH

1: Sham-operated group; 2: Model group; 3: MHBFC 6 mg·kg-1group; 4: MHBFC 12 mg·kg-1group; 5: MHBFC 12 mg·kg-1+L-NAME 50 mg·kg-1group; 6:L-NAME 50 mg·kg-1group.

Tab 3 Effect of MHBFC on expression of p-eNOS, p-PI3K and p-Akt proteins in MMVEC of rats with pressure overload-induced ventricular n=5)

#P<0.05vssham-operated;*P<0.05vsmodel;△P<0.05vsL-NAME 50 mg·kg-1

4 討論

通過(guò)縮窄腹主動(dòng)脈誘導(dǎo)心室重構(gòu)模型是目前常用的一種方法。縮窄大鼠的腹主動(dòng)脈會(huì)導(dǎo)致后負(fù)荷迅速增加，在短時(shí)間內(nèi)很容易導(dǎo)致心肌肥厚，一般造模4周就可出現(xiàn)心血管重構(gòu)的主要病理生理性改變[7]。內(nèi)皮功能障礙會(huì)導(dǎo)致血管舒縮功能障礙、內(nèi)皮通透性增加、血小板黏附聚集、細(xì)胞因子產(chǎn)生等，促進(jìn)心室重構(gòu)向心衰發(fā)展。尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷會(huì)導(dǎo)致高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等血管損傷性疾病。由eNOS合成的NO能調(diào)節(jié)血管張力，抑制血小板黏附與聚集，改善血管內(nèi)皮舒張功能，改善血流剪切應(yīng)力，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[8]。

研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞的分泌功能是非常強(qiáng)大的，其中MMVEC不僅可以調(diào)節(jié)血管的舒縮功能、血管壁的通透性、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖等，而且還能釋放一些生物活性物質(zhì)，如NO、前列環(huán)素、血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素-1等，調(diào)節(jié)心肌組織功能[9]。本實(shí)驗(yàn)選擇MMVEC作為研究對(duì)象，大鼠造模給藥結(jié)束后，采用酶化學(xué)消化法分離培養(yǎng)大鼠原代MMVEC，分離獲得的MMVEC表現(xiàn)典型的鋪路石樣結(jié)構(gòu)，而且通過(guò)采用比較公認(rèn)的Dil-Ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)鑒定，證實(shí)該細(xì)胞為MMVEC。該分離培養(yǎng)方法獲得的MMVEC純度高，數(shù)量多，生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)得快，是目前分離培養(yǎng)原代MMVEC較成熟的一種方法。前期研究發(fā)現(xiàn)MHBFC能改善MMVEC的分泌功能，增加NO合成和釋放，抑制MMVEC凋亡，發(fā)揮抗心肌肥大作用，逆轉(zhuǎn)大鼠壓力超負(fù)荷心室重構(gòu)。

eNOS-NO信號(hào)通路介導(dǎo)MMVEC中的eNOS催化產(chǎn)生保護(hù)性的NO，在壓力超負(fù)荷心室重構(gòu)中主要表現(xiàn)為抗心肌肥大作用。L-NAME是NOS抑制劑，其能抑制NOS活性，減少NO生成，不僅可以升高血壓，而且還會(huì)促進(jìn)左心室重構(gòu)發(fā)生和發(fā)展[10]。單獨(dú)給予NOS阻斷劑L-NAME 6周后，MMVEC p-eNOS蛋白表達(dá)比模型組明顯降低，但合用MHBFC組MMVEC p-eNOS蛋白表達(dá)水平比模型組上調(diào)，且eNOS蛋白磷酸化表達(dá)水平明顯高于L-NAME組。提示MHBFC能提高eNOS酶活性，增加NO含量，且該調(diào)控機(jī)制可能與MHBFC能明顯增加eNOS蛋白磷酸化水平有關(guān)。

eNOS可在多個(gè)絲∕蘇氨酸位點(diǎn)上發(fā)生磷酸化或去磷酸化反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)eNOS酶活性及NO的產(chǎn)量。研究已經(jīng)證實(shí)，提高eNOS活性，增加p-eNOS的表達(dá)量具有明顯的降壓和抗心肌肥大作用[11]。另外，PI3K和Akt是eNOS-NO信號(hào)通路上游的重要調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)、心肌肥大和心力衰竭的發(fā)展進(jìn)程中起著重要作用[12]。激活PI3K/Akt信號(hào)通路，能上調(diào)p-Akt的表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡，改善心肌肥大，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，MHBFC預(yù)處理組MMVEC eNOS、PI3K和Akt蛋白磷酸化水平比模型組均明顯上調(diào)，且MMVEC eNOS、PI3K、Akt mRNA表達(dá)也明顯上調(diào)，但L-NAME組MMVEC eNOS蛋白磷酸化水平及eNOS mRNA相對(duì)表達(dá)水平比模型組明顯降低，而合用MHBFC組MMVEC eNOS、PI3K和Akt蛋白磷酸化水平及基因表達(dá)水平比L-NAME組均明顯上調(diào)。提示MHBFC增加MMVEC eNOS蛋白磷酸化和基因表達(dá)，與其增加eNOS-NO信號(hào)通路上游的MMVEC p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)及MMVEC PI3K、Akt mRNA表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，MHBFC逆轉(zhuǎn)壓力超負(fù)荷心室重構(gòu)的調(diào)控機(jī)制可能是通過(guò)增加eNOS-NO信號(hào)通路上游MMVEC PI3K和Akt 蛋白磷酸化，以及增加MMVEC PI3K、Akt mRNA表達(dá)，進(jìn)而增加MMVEC eNOS蛋白磷酸化及eNOS mRNA表達(dá)，激活eNOS-NO信號(hào)通路，從而對(duì)壓力超負(fù)荷引起的心肌損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。激活eNOS-NO信號(hào)通路后，MHBFC具體如何發(fā)揮保護(hù)心肌損傷作用，還需進(jìn)一步研究。