屈紅林，謝 軍，陳嘉勤，劉瑞蓮，彭 琪，李 娣，陳 偉，陳伊琳，陳 銳，卲長鳳，袁阿芳

抑郁癥又稱為抑郁障礙性疾病，是以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征的心境障礙類精神疾病[1]。臨床上已經(jīng)證實抑郁癥不只是簡單的心理病變，同時還是一種功能性病變，且隨著病程的延展，易造成患者大腦海馬區(qū)病變，隨即功能性病變就會轉(zhuǎn)化為器質(zhì)性病變[2]，造成海馬神經(jīng)元變性[3-4]、萎縮[5]與丟失[6]等，并已被眾多學者所證實[7-8]。有研究指出，抑郁癥患者前額皮層與海馬區(qū)的BDNF的表達減少，功能受損，致使神經(jīng)元萎縮，血液中BDNF的水平降低，而抗抑郁治療能夠增加BDNF的表達，阻斷由于抑郁壓力導致的生長因子表達的缺陷[9]。也有研究提出質(zhì)疑，在動物試驗中，BDNF敲除后并未出現(xiàn)抑郁樣癥狀，同時，除海馬和前額皮層外的其他腦區(qū)，如伏隔核、腹側(cè)被蓋區(qū)等BDNF的高表達反而對抑郁起到了加重作用，由此，實驗人員[10]認為抑郁癥發(fā)病機制的BDNF假說僅局限于海馬區(qū)域及五羥色胺再攝取抑制劑（Selective Serotonin Reuptake Inhibitors，SSRIs）的作用效果。B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）作為細胞凋亡研究中最受重視的基因之一，以其抑制凋亡的作用倍受關注。Bcl-2的過度表達能增強所觀察細胞對大鼠細胞毒素的抵抗作用，這一作用引導人們認識凋亡的各信號轉(zhuǎn)導路徑有了一個共同的交匯點。從前期的研究來看，Bcl-2抑制細胞凋亡的可能作用機制與降低氧自由基的產(chǎn)生與脂質(zhì)過氧化物的形成[11-12]、抑制鈣離子跨膜流動[13-15]、離子通道蛋白[16]及其吸附/錨定蛋白等[17]的作用機制關系密切。最新的研究表明，抑郁大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡因子顯著增加，并伴有顯著的抑郁樣行為[18-19]，有氧運動可通過提高慢性應激實驗鼠海馬神經(jīng)的可塑性發(fā)揮抗抑郁作用[20]，但有氧運動是否能夠干預抑郁鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡及其作用機制鮮有報道。

有文獻[21]報道，miR-195可抑制細胞周期的轉(zhuǎn)換，誘導細胞凋亡的發(fā)生，在癌癥、腫瘤及心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮作用。miR-195可以通過抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖，調(diào)控Caspase-3和Caspase-9的活性促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡與壞死[22-25]，促進對膠質(zhì)瘤的治療作用。N.MELLIOS等[26]的報道顯示精神分裂癥患者腦脊液中的miR-195可通過調(diào)節(jié)BDNF的表達，改變下游γ-氨基丁酸能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄過程，由此可見，BDNF與miR-195的調(diào)控作用可能在認知功能中發(fā)揮作用。瞿準等[27]的研究結(jié)果顯示，創(chuàng)傷性腦損傷患者血清與模型鼠腦組織中miR-195水平顯著高于對照組，抑制神經(jīng)細胞生長增殖并促進其凋亡，而BDNF可通過抑制miR-195的表達促進神經(jīng)細胞生長增殖，抑制其凋亡。R.SINGH等[28]研究發(fā)現(xiàn)，miR-195的種子位點與Bcl-2結(jié)合后，便抑制或降解Bcl-2的表達，增強活化Caspase的促凋亡過程[29]，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖[30]。潘瑩等[31]研究也證實了這一觀點，即miR-195可通過調(diào)控Bcl-2/Bax途徑抑制細胞增殖或促進細胞凋亡。神經(jīng)元變性引起的海馬體積萎縮[32]與神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)與功能退化[33-34]是重癥抑郁癥患者影像學與尸檢發(fā)現(xiàn)的又一重要病理特征。那么有氧運動是否會抑制抑郁模型動物海馬神經(jīng)退變與凋亡，miR-195是否參與其中并不清楚。由此，課題組針對CUMS抑郁小鼠的海馬組織miRNA與mRNA進行了高通量測序并對miRNA與mRNA的測序結(jié)果進行相關性分析，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-195與海馬神經(jīng)細胞的凋亡存在高度相關性，且這一結(jié)果還會明顯受到有氧運動干預的影響（論文待發(fā)表）。因此，本研究擬探討有氧運動對CUMS抑郁小鼠海馬miR-195及其BDNF/miR-195/Bcl-2信號通路表達和海馬功能的影響。

1 研究對象與方法

1.1 主要試劑和儀器

主要試劑：DAB顯色試劑盒（武漢博士德）、ELISA試劑盒（ABclonal，美國）、Trizo（lInventragtion）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，美國）、兔抗多克隆抗體BDNF、Bcl-2（CUSABIO）、PCR mRNA引物（由上海生工設計與合成）、miRNA引物（由廣州銳博生物科技有限公司設計與合成）、蛋白裂解液、TUNEL試劑盒（Sigma-A ldrich）。

主要儀器：YD-6D型生物組織石蠟包埋機、YD-A生物組織攤烤片機、LEICA RM 2235切片機、Bio-Rad電泳儀與電泳槽、MB16-414酶標儀、Bio-Rad CFX96Touch實時熒光定量PCR儀、Nikon Eclipse Ti-SR正置熒光顯微鏡、Nikon DS-U3成像系統(tǒng)、T10Basic高速組織勻漿機。

1.2 動物分組與CUMS抑郁模型制備

動物分組：8周齡健康雄性KM種屬小鼠36只（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK湘2016-0002），隨機數(shù)字法分為對照組（ControlGroup，CG）、CUMS抑郁模型組（Model Group，MG）和抑郁+有氧運動組（Depression and exercise Group，EG），每組12只。所有動物在室溫為（25±1）℃、濕度50%的標準動物房內(nèi)飼養(yǎng)，標準齒啃類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲食，光照時間各為12 h。CG組常規(guī)籠內(nèi)安靜飼養(yǎng)，MG和EG組進行CUMS抑郁造模，EG組造模成功后進行為期8周的有氧運動跑臺訓練。

CUMS抑郁模型制備：造模實驗動物適應性喂養(yǎng)1周后，借鑒馬柯[35]、信欣等[36]CUMS抑郁造模方法改良進行13種慢性不可預知性應激因子（晝夜調(diào)整、光照性質(zhì)、禁食、禁水、傾斜45℃鼠籠、潮濕墊料、4℃冰水游泳、45℃高溫游泳、水平震蕩、輕夾鼠尾、束縛、白噪音、間斷閃光）刺激，應激因子按照隨機數(shù)字法生成刺激方案，并依據(jù)相鄰兩天實施不同刺激做出微調(diào)，以防實驗動物產(chǎn)生適應，每天按照1～2種刺激安排，總造模時間為28天。

1.3 有氧運動方案

有氧運動方案參考Bedford訓練模型[37]略加改動，EG組小鼠在造模成功后進行適應性跑臺運動1周，適應性訓練按照開始強度為10m/min，0°坡度，每天遞增10min，共計6天。正式訓練以10m/min，0°坡度，60min/d，6天/周，連續(xù)訓練8周。運動訓練時間均安排在上午9：00-10：30進行。上述訓練方案無小鼠死亡。

1.4 神經(jīng)行為學評定

強迫游泳（Forced Sw imming Test，F(xiàn)ST）：采用直徑為10 cm，容量為2 L的圓形燒杯，水深10 cm，水溫控制在（25±1）℃，ANC酷睿HD1080P高清攝像頭記錄小鼠6min內(nèi)不動狀態(tài)潛伏期與第3～6min內(nèi)的不動總時間。

強迫懸尾（Tail Suspension Test，TST）：采用自制周壁與底部均為黑色、箱體頂部有25W白熾燈照明的懸尾箱，V11.60.00正版監(jiān)控軟件錄像，記錄實驗鼠6min內(nèi)不動狀態(tài)潛伏期與第3～6min內(nèi)的不動總時間。

上述神經(jīng)行為學評定過程中，為減少人為誤差，每只小鼠采取3人同時觀察與記錄，取平均值。

1.5 樣本處理及生化指標檢測

腦在體固定及腦組織取樣：8周有氧跑臺運動結(jié)束，當天進行神經(jīng)行為學評定。所有小鼠禁食過夜，次日按照50mg/kg體重的劑量腹腔注射1%的戊巴比妥鈉麻醉后，每組隨機選取2只小鼠，迅速開胸，用頭皮針自心尖處刺入主動脈，動脈夾固定，快速用眼科剪于右心耳處剪開，4℃的冰生理鹽水快速灌注，后改用4%的多聚甲醛溶液灌注，直至小鼠身體及尾巴完全僵硬、肝臟腫大且為白色為止。灌注結(jié)束后，冰上迅速剪開頭皮，暴露顱骨，從枕骨大孔沿顱骨的矢狀縫剝離顱骨和腦膜，剪刀靠近顱骨底部小心取出腦組織，置于4%的多聚甲醛溶液固定48 h以上。

血液取樣與生化檢測：麻醉同上，開胸后，2m L真空抗凝管自心臟抽取新鮮血液，冷凍離心提取上清液。嚴格按照試劑盒說明書對血清BDNF含量進行檢測。

海馬組織取樣：處死后的小鼠冰上剝離頭部皮膚，暴露顱骨，眼科鑷自枕骨大孔輕輕撬開顱骨，充分暴露腦組織，小心剝離大腦左右皮層，暴露整個海馬組織，玻璃分針剝離海馬組織與大腦皮層及周圍的腦組織，取出海馬，冰PBS沖洗，濾紙吸掉多余水分，Trizol浸泡，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 TUNEL法檢測海馬神經(jīng)細胞凋亡率

4%的多聚甲醛對小鼠進行心臟在體灌注后取腦，4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，進行梯度乙醇脫水、石蠟包埋，冠狀切片，依次進行二甲苯梯度脫蠟、梯度乙醇復水、Proteinase K工作液37℃反應30min、PBS漂洗3×5min，室溫固定30min，PBS漂洗3×5min，浸入封閉液，室溫封閉10min，PBS漂洗3×5min，進行標記反應，即加入TUNEL反應液，置于濕盒中避光反應，37℃×1 h（除陰性對照組補加TdT酶外，其余組加入50μLTdT+450μL dUTP液），去離子水稀釋20×SSC（比例1：10）室溫15 min終止反應，PBS漂洗3×5min，浸入0.3%H2O2/PBS中封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育5min，PBS漂洗3×5min，滴加50μLStreptavidin-HRP工作液，濕盒避光37℃反應30min，50～100μLDAB顯色劑與底物反應顯色，去離子水漂洗數(shù)次，蘇木素對細胞核選擇性復染，中性樹膠封片，光學顯微鏡下進行TUNEL陽性細胞計數(shù)，計數(shù)時針對每張片的小鼠海馬CA區(qū)隨機選取10個高倍視野（40×10倍），計算細胞凋亡率。TUNEL陽性細胞形態(tài)多樣化呈灰褐色，即凋亡細胞，正常細胞形態(tài)多為圓形并呈成藍紫色。

1.7 免疫組織化學染色

石蠟包埋與切片同上。切片脫蠟至復水，蒸餾水漂洗，微波抗原修復，PBS清洗，于濕盒中，免疫組化筆標記，干燥后再濕潤，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min，一抗孵育（BDNF，1：50），4℃過夜，PBS清洗，二抗孵育（37 ℃，20min），PBS清洗，滴加新鮮配制的DAB顯色液，室溫放置3～5min，流水沖洗，終止顯色反應（必要時需要復染或進行濃硫酸降解），滴加蘇木素復染，室溫放置3min，流水沖洗，風干后，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察海馬組織內(nèi)神經(jīng)核的陽性細胞及其定位，細胞核藍染，胞漿或細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著即為陽性細胞。每組均設置空白對照（PBS代替一抗、二抗）和陰性對照（PBS代替一抗）。

1.8 western blot

海馬組織約23mg，電動研磨器研磨粉碎，蛋白裂解液提取總蛋白質(zhì)，酶標儀測定蛋白質(zhì)濃度，并將各組勻漿總蛋白濃度用PBS調(diào)整一致，進行蛋白定量。等量蛋白質(zhì)上樣、電泳、轉(zhuǎn)模后，3%的（W/V）脫脂牛奶的TBST封閉2 h，加入兔抗多克隆抗體BDNF（1：1 000），4 ℃過夜，室溫復溫30min后，加入顯色劑綴合的抗兔IgG二抗抗體（1：2 000）孵育1 h，TBST清洗，ECL發(fā)光。內(nèi)參為β-actin（1：10 000）。觀察條帶并拍照。

1.9 總RNA提取

取小鼠海馬組織，使用Trizol試劑，按照說明書試驗流程提取總RNA，并用Q5000超微量分光光度計測定總RNA質(zhì)量和濃度。

1.10 RT-PCR

常規(guī)Trizol試劑提取海馬總RNA，嚴格按照高容量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKAEA Bio，日本）說明書操作步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，后進行RT-PCR反應，管家基因為GAPDH。BDNF、Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAPDH等的引物序列見表1。反應條件為95 ℃ 10min，1循環(huán)預變性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，40循環(huán)PCR反應；72 ℃ 10min，退火。每樣復孔3次，利用2-△△Ct法計算相對基因表達量。

表1 m RNA基因引物序列Table1 The Gene Primers

海馬組織總RNA提取同上。按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以此cDNA為模板按PCR試劑盒說明書進行PCR反應。引物由銳博生物科技有限公司設計與合成，U6為內(nèi)參。反應條件為95℃30 s，1循環(huán)預變性；95℃5 s，65℃30 s，39個循環(huán)PCR反應，95℃30 s退火。每樣復孔3次，利用2-△△Ct法計算miR-195的相對基因表達量。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理。顯著性差異，選擇P＜0.01與P＜0.05水平。所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（X±SD）表示。

2 研究結(jié)果

2.1 CUMS抑郁小鼠造模效果評定

對CG組和MG組小鼠神經(jīng)行為學評定（見圖1a）結(jié)果顯示，CG組小鼠神經(jīng)行為功能正常，求生欲望強烈；MG組小鼠在抑郁后強迫游泳和強迫懸尾的不動時間顯著延長。ELISA檢測結(jié)果顯示，MG組較CG組小鼠血清BDNF水平下降（P＜0.01，見圖1b）。免疫組化檢測結(jié)果如圖3所示，CG組小鼠BDNF陽性細胞廣泛分布于海馬的CA1、CA4區(qū)的錐體細胞層與齒狀回的顆粒細胞層，形態(tài)規(guī)則著色較深且排列密集；MG組小鼠海馬BDNF陽性細胞數(shù)量顯著減少，散在分布且有些細胞呈空泡狀或萎縮狀，胞漿著色淺，胞體減小甚至消失。TUNEL細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，MG組小鼠海馬CA區(qū)凋亡細胞數(shù)顯著增加（P＜0.01，見表2）。MG組小鼠海馬BDNF的RT-PCR檢測結(jié)果，也顯示顯著降低。依據(jù)以上相關檢測結(jié)果，可以認定CUMS抑郁模型造模成功。

圖1 8周有氧運動結(jié)束后各組小鼠FST、TST評定結(jié)果、血清BDNF含量變化柱狀圖Figure1 The Changed Result in Mice After 8Weeks

2.2 CUMS抑郁小鼠海馬BDNF/miR-195/Bcl-2信號通路相關基因的差異表達

MG組小鼠海馬BDNF表達下調(diào)，miR-195表達增加（P＜0.01，與CG組相比），Bcl-2表達雖有降低，但不呈顯著性差異（P＞0.05），而Bax和Caspase-3mRNA表達均顯著增加（P＜0.01）（見圖2），提示模型組小鼠海馬神經(jīng)的miR-195表達增加，靶向抑制Bcl-2的表達，顯著激活促凋亡基因，內(nèi)源性凋亡信號通路中凋亡蛋白表達顯著增加，海馬神經(jīng)細胞凋亡作用顯著，功能降低。

圖2 各組小鼠海馬m RNA、miR RT-PCR檢測結(jié)果示意圖Figure2 The Changed Expression ofmiR-195，BDNF，Bcl-2，Bax and Caspase-3 in M ice Hippocam pus

2.3 有氧運動激活BDNF/miR-195/Bcl-2信號通路相關基因表達抑制海馬凋亡，促進功能修復

EG組小鼠強迫游泳和強迫懸尾的不動時間趨于正常，提示有氧運動能提高CUMS抑郁小鼠的求生欲望，有效地保護海馬免受抑郁損傷。EG組海馬組織BDNF表達顯著性增加，miR-195表達減少（P＜0.01，與MG相比），Bcl-2表達水平顯著升高（P＜0.01，見圖2），BDNF的這一結(jié)果在ELISA檢測結(jié)果得到驗證（見圖1）；Bax和Caspase-3mRNA表達水平顯著降低。揭示有氧運動可能對上述凋亡基因的激活有抑制作用。相關性分析結(jié)果還顯示，海馬BDNF與miR-195呈顯著性負相關。從BDNF免疫組化與TUNEL細胞凋亡的檢測結(jié)果來看，有氧運動雖不能有效修復因抑郁導致的海馬神經(jīng)核萎縮與空泡樣變性，但EG組小鼠海馬組織的BDNF陽性細胞表達數(shù)量明顯增加，部分胞體輪廓清晰，胞漿著色明顯且形態(tài)完整（見圖3）。相同視野區(qū)域下的TUNEL細胞凋亡檢出率也得到有效控制（P＜0.01，見表2）。提示有氧運動可有效抑制CUMS抑郁小鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)展，這可能與有氧運動促進海馬齒狀回神經(jīng)細胞增殖有關。

圖3 各組小鼠BDNF表達變化Figure3 The Changed Expression of BDNF in Mice

表2各組小鼠海馬BDNF陽性細胞與TUNEL細胞凋亡率檢測結(jié)果統(tǒng)計表Tab le2 The Resultof Apop totic Rate o f BDNA Positive Cells and TUNELCells in Hippocampus

2.4 BDNF與miR-195及其與細胞凋亡間的關系

miR-195隸屬miR-15家族，其序列是哺乳動物特有，并具有高度保守性[38]。目前已證實其成熟序列為：5’-UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC-3’，可通過與靶基因不完全互補抑制靶基因的翻譯[39]，有研究顯示其作用的靶基因主要包括WEE1、CDK6、Bcl-2、BDNF、Arl2、FLT3等[40]。從Targetscan 6.2預測軟件獲取miR-195與BDNF基因3’UTR區(qū)互補結(jié)合位點，據(jù)此構(gòu)建miR-195種子區(qū)突變體堿基對。miR-195與BDNF間可能的作用關系，如圖4所示，BDNF的3’UTR端具有miR-195的結(jié)合位點，因此miR-195能特異性作用于BDNF的3’UTR，抑制BDNF的表達[41]，且除了miRNA轉(zhuǎn)錄后抑制BDNF表達外，BDNF自身也能調(diào)節(jié)miR-195的表達。Pearson線性相關分析結(jié)果顯示，miR-195表達水平與BDNF表達水平呈顯著性負相關（r=0.779，P＜0.01）。在研究中我們發(fā)現(xiàn)miR-195顯著抑制Bcl-2的蛋白表達水平。Pearson線性相關分析顯示，miR-195表達水平與Bcl-2表達水平呈顯著性負相關（r=0.606，P＜0.01）（見圖5-7）。

圖4 miR-195與BDNF的序列比對Figure4 Target Validation of miR-195

圖5 BDNF的western blot檢測結(jié)果Figure5 The BDNF Result of western blot

圖6 ME組miR-195與BDNF間的相關性分析Figure6 The Relation Between miR-195 and BDNF of MEGroup

圖7 ME組miR-195與Bcl-2間的相關性分析Figure7 The Relation Between miR-195 and Bcl-2 of MEGroup

3 分析與討論

實驗采用慢性不可預見性應激刺激進行抑郁造模，與人類抑郁癥患者中慢性、低水平的應激源誘發(fā)抑郁癥的作用機理較為接近，也是研究抑郁癥病理改變的良好模型，倍受國內(nèi)外專家學者的廣泛認可與應用[42]。抑郁后海馬功能發(fā)生改變，進而影響前額葉皮質(zhì)、杏仁核與伏隔核神經(jīng)環(huán)路功能[43]，誘導下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）[44]、下丘腦-垂體-甲狀腺軸（HPT軸）[45]等應激反應的失調(diào)，HPA軸功能的亢進又易引起血液與腦內(nèi)糖皮質(zhì)激素水平的升高，高濃度的糖皮質(zhì)激素又反過來選擇性的損傷大腦海馬神經(jīng)元[46]，造成惡性循環(huán)，進一步損傷抑郁癥患者海馬神經(jīng)，導致包括神經(jīng)元再生障礙、神經(jīng)營養(yǎng)低下等的海馬神經(jīng)元病理性改變[47]。本實驗室前期的研究也已經(jīng)證實，有氧運動可有效改善缺血性腦損傷及海馬功能紊亂[48]。本研究發(fā)現(xiàn)實驗小鼠產(chǎn)生抑郁時，海馬神經(jīng)功能下降，BDNF的表達下調(diào)，出現(xiàn)細胞空泡狀或萎縮狀，胞漿著色淺，胞體小或消失，細胞凋亡率增加明顯，呈現(xiàn)顯著的抑郁癥海馬癥狀特征。實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)miR-195的表達顯著增強，同時，促凋亡基因Bax、Caspase-3的表達顯著升高（P＜0.01，與CG組相比），推測此凋亡過程可能與抑郁小鼠BDNF的下調(diào)誘導miR-195的表達升高，促使促凋亡因子Bax、Caspase-3等的高表達有關，而抑凋亡因子Bcl-2的表達未呈現(xiàn)顯著性改變。

有氧運動抑制海馬神經(jīng)細胞凋亡的研究已經(jīng)得到證實[49-51]，但針對有氧運動對抑郁后海馬保護效應的機制研究報道較少，僅限于神經(jīng)可塑性及空間學習與記憶能力等的研究[52-54]。本研究結(jié)果顯示，MG小鼠血清BDNF蛋白含量和海馬BDNFmRNA表達較CG組明顯降低，有氧運動能顯著提高海馬功能，增強CUMS抑郁小鼠的求生欲望，顯著降低強迫游泳和強迫懸尾的不動持續(xù)時間，增加海馬BDNF的表達及血清BDNF的活性，改善了抑郁小鼠海馬功能。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，抑郁小鼠在8周的有氧運動干預后海馬神經(jīng)細胞Bax、Caspase-3的促凋亡因子的表達量顯著降低，Bcl-2抗凋亡因子的表達量顯著增高。說明，有氧運動可促進BDNF和抗凋亡因子Bcl-2mRNA的表達，下調(diào)miR-195的表達，從而抑制促凋亡因子Bax、Caspase-3mRNA等的表達，具有顯著性意義。

本實驗海馬神經(jīng)形態(tài)學測試的結(jié)果顯示，持續(xù)8周的有氧運動并不能修復抑郁小鼠已萎縮和空泡樣的海馬神經(jīng)元，這可能與抑郁小鼠海馬結(jié)構(gòu)損害的不可逆性關系密切。但測試的結(jié)果也反映出抑郁小鼠海馬功能得到了明顯改善，一方面，可能與有氧運動增加海馬神經(jīng)細胞血供，促進新的突觸神經(jīng)生成及聯(lián)系增多[55]、海馬體活躍度增強[56]，海馬齒狀回的神經(jīng)細胞增殖[57-58]，調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)發(fā)生增加[59]，促使神經(jīng)再生發(fā)芽[60]，BDNF的表達上調(diào)，進而抑制TUNEL陽性細胞的表達等有關[61]；另一方面，還可能與有氧運動促進前額葉、海馬齒狀回、杏仁核中的某些決定神經(jīng)可塑性的蛋白質(zhì)增加有關[62]，如過氧化物酶體增殖劑激活受體（Peroxisome Proliferator Activated Receptor y，PPARy）、磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、突觸素（Synaptophysin）和胱天蛋白酶9（Caspase-9）等表達上調(diào)，這一結(jié)果在高通量測序中得到驗證（論文待發(fā)表）。實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，有氧運動調(diào)控了海馬Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的變化，且這一變化與TUENL陽性細胞的表達相適應。

有研究表明，miR-195高表達于機體腦部，且在乳腺[63-64]、前列腺[65-66]、子宮內(nèi)膜[67]、消化道如大腸[68-69]等的細胞增殖與凋亡中發(fā)揮重要作用，尤其是在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤方面的作用[70-71]，倍受關注。研究人員發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-195在多種腫瘤中具有抗腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移的作用，一方面，可抑制腫瘤細胞增殖，削弱平板克隆形成能力，促進細胞凋亡[72]，另一方面參與腫瘤的生長[73]、增殖[74-75]、凋亡[76]、侵襲與遷移[77]等的調(diào)節(jié)。miR-195除參與腫瘤細胞的凋亡與轉(zhuǎn)移外，是否參與其他慢性病的細胞凋亡？有研究顯示miR-195抑制劑可顯著降低缺氧和H2O2處理的心肌細胞凋亡，提高細胞活力[78-79]，同樣在心肌缺血再灌注損傷實驗中，miR-195的過表達除可降低Bcl-2mRNA的蛋白表達外，還增加Bax、Cyt、Caspase-3和Caspase-9mRNA的蛋白表達，相反下調(diào)miR-195可增加Bcl-2 mRNA的表達，降低Bax mRNA的表達[80]。張帥等[81]的研究發(fā)現(xiàn)miR-195以多靶點調(diào)控的方式參與血管性癡呆動物模型神經(jīng)元突觸退化與神經(jīng)元死亡的發(fā)生與發(fā)展過程；相似的研究還包括，miR-195的表達被抑制后引起小鼠在Morris水迷宮中潛伏期延長，穿越平臺位置的次數(shù)明顯減少[82]。因此，miR-195除了參與腫瘤細胞的增殖與凋亡外，在神經(jīng)細胞的凋亡及海馬功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。推測miR-195可能參與海馬神經(jīng)元的增殖與凋亡過程。因此認為，miR-195的高表達易引起海馬神經(jīng)元凋亡，減弱海馬功能。運動作為機體內(nèi)源性物質(zhì)表達分泌的重要途徑，是否能通過直接或間接信號通路誘導miR-195的差異表達？這方面的研究鮮有報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，BDNF有可能抑制miR-195的表達水平，阻止海馬神經(jīng)凋亡。由于實驗條件限制，未能進行miR-195模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染后檢測BDNF蛋白的表達以及BDNF阻斷后的miR-195表達情況，但已有的文獻[83]報道顯示miR-195可能負調(diào)控BDNF蛋白的表達，彌補前額葉γ-氨基丁酸能mRNA缺陷，miR-195與BDNF呈顯著性負相關。本實驗結(jié)果顯示系統(tǒng)的有氧運動可顯著增加CUMS抑郁小鼠海馬BDNF的表達，下調(diào)miR-195的差異表達，二者也呈顯著性負相關。CUMS抑郁小鼠海馬組織的RT-PCR檢測結(jié)果還顯示miR-195還可以通過抑制Bcl-2的表達增強活化Caspase的凋亡過程，而有氧運動可以逆轉(zhuǎn)這一過程。有氧運動誘導的miR-195與Bcl-2表達水平的相關性分析發(fā)現(xiàn)，二者存在負相關關系。因此推測，系統(tǒng)的有氧運動可能通過激活抑郁小鼠海馬組織BDNF的表達水平，下調(diào)miR-195的表達，進一步增強抗凋亡基因Bcl-2的表達水平，拮抗Bax、Caspase等促凋亡因子的差異表達，發(fā)揮拮抗神經(jīng)細胞凋亡，改善海馬神經(jīng)功能。

4 結(jié)論

CUMS抑郁小鼠海馬功能降低，可能通過miR-195的上調(diào)靶向抑制Bcl-2，使促凋亡因子表達增高，促進海馬細胞凋亡的發(fā)生。有氧運動可顯著提高抑郁小鼠海馬BDNF的表達，抑制miR-195的促凋亡作用，降低促凋亡因子的表達水平，發(fā)揮抗凋亡作用。有氧運動改善抑郁小鼠海馬功能，發(fā)揮海馬保護效應，可能與BDNF/miR-195/Bcl-2信號通路的激活有關。但miR-195模擬物或抑制劑以及BDNF增強劑是否能夠阻斷或增強該信號通路的調(diào)控作用，進一步發(fā)揮對海馬神經(jīng)細胞的抗凋亡的作用機制有待進一步研究。