楊凡，余小強，華福洲，應(yīng)俊，王羲鳳

作者單位： 342500江西省瑞金，瑞金市人民醫(yī)院（楊凡、余小強）；南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院（華福洲、應(yīng)?。?；南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院（王羲鳳）

消化道潰瘍是臨床常見消化道疾病，我國消化道潰瘍發(fā)病率為17.32%[1]。消化道穿孔需要手術(shù)治療，雖然大部分可以治愈，但是對老年患者及糖尿病等免疫功能抑制患者，仍會導(dǎo)致愈合不良或吻合口瘺的發(fā)生[2]。脂肪間充質(zhì)干細胞（ADMSC）是一類臍帶血組織中分離得到的成體干細胞，能定向分化成骨、脂肪和平滑肌細胞等多種體細胞[3]。此外，ADMSC分泌多種抗炎和免疫抑制因子，如血管內(nèi)皮增長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子 1（TGF-1）和胰島素生長因子等[4]，從而促進組織損傷修復(fù)和再生。目前已證實干細胞對修復(fù)動物和人的心、腦、腎及肝等臟器損傷具有一定療效[5-7]，但對消化道傷口愈合療效有待進一步研究。本研究擬觀察采用局部注射ADMSC對大鼠胃切開縫合傷口愈合情況，報道如下。

1 資料與方法

1.1 試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、青（鏈）霉素、胰酶-EDTA、胎牛血清（FBS）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）及磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國GIBCO公司；牛血清蛋白（BSA）及DAH染液來自于上海生物工程股份有限公司；I型膠原酶及三硝基苯磺酸購自美國Sigma公司。大鼠ADMSC成脂及成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基購于美國Sciencll公司；CD29、CD90及CD45流式抗體購于美國BD公司，ADMSC誘導(dǎo)分化試劑盒購自Invitrogen公司，戊巴比妥鈉及一抗（IL-6）購于Abcam公司，二抗（山羊抗兔IgG）購于北京中杉公司。

1.2 動物分組和模型建立 清潔雄性SD鼠（3個月齡），體質(zhì)量220～260 g，由南昌大學(xué)動物部提供，術(shù)前適應(yīng)1d，共36只，通過南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組和局部注射ADMSC組（ADMSC組），各18只。兩組均予建立胃穿孔縫合手術(shù)模型，造模前24 h禁食不禁水，具體實驗方法參考文獻[8]，ADMSC組用100l的注射器給予縫合口注射注射70l ADMSC（5×106個/只），術(shù)后給予正常飲食飲水。

1.3 ADMSC的分離培養(yǎng)和純化 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉并碘伏消毒腹股溝區(qū)皮膚后，切取腹股溝區(qū)皮下脂肪組織；在無菌操作臺內(nèi)，75%酒精消毒及滅菌PBS沖洗3次后，用眼科剪剪碎脂肪組織；加入0.75%I型膠原蛋白酶37℃震蕩消化30 min；過濾去除組織碎片后，1 200 g離心過濾液10 min；低糖DMEM完全培養(yǎng)基（含20%FBS）培養(yǎng)離心后的細胞，培養(yǎng)密度為5×104/cm2，48 h后更換培養(yǎng)液，貼壁的細胞即為ADMSC。ADMSC生長至70%～80%進行傳代；第一次傳代獲得的 ADMSC為第一代（P1）,使用P3～P5進行后續(xù)試驗。為保持ADMSC的“干性”，本實驗僅使用第3～5代ADMSC。

1.4 ADMSC的標(biāo)記及鑒定 根據(jù)國際細胞治療協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)鑒定 ADMSC：（1）細胞貼壁生長；（2）細胞表面抗原：將80%P3 ADMSC消化、充分吹打，調(diào)整細胞濃度為（1～3）×106/ml；每毫升ADMSC懸液加入CD29、CD90和CD45一抗，使用流式細胞儀檢測ADMSC表面抗原陽性率；（3）鑒定ADMSC分化潛能：使用ADMSC誘導(dǎo)分化試劑盒培養(yǎng)誘導(dǎo)ADMSC定向分化成脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞。

1.5 組織病理學(xué)分析 胃穿孔縫合后3及5d處死大鼠，盲法評估大鼠胃傷口的修復(fù)情況（每組n=6）：取胃傷口組織，甲醛固定，梯度乙醇脫水，包埋切片，蘇木素伊紅（HE）染色，光鏡下評估胃黏膜損傷程度和修復(fù)情況。依據(jù)常用的1970年 CHIU等報道的病理評分標(biāo)準(zhǔn)，高倍鏡下（×400）選取5個非重疊視野，評估胃組織損傷并進行評分。

1.6 組織免疫熒光分析 胃組織經(jīng)過甲醛固定、脫水、石蠟包埋和切片；包含胃組織的石蠟切片進行脫蠟、抗原修復(fù)和血清封閉后，滴加一抗4℃撫育過夜；PBS洗3次后，加二抗室溫下?lián)嵊胄r；PBS洗3次并加入ABC復(fù)合物室溫撫育半小時后，加DAB顯色。

1.7 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADMSC的生物學(xué)特性鑒定 ADMSC具有紡錘形態(tài)、貼壁生長特點和成脂、成骨的分化潛能，流式細胞分析顯示ADMSC對CD29及CD90高表達（封二彩圖6a、封二彩圖6b），而對CD45低表達（封二彩圖6c）。

2.2 胃傷口愈合情況 ADMSC組在術(shù)后3及5 d的愈合情況顯著好轉(zhuǎn)（封二彩圖7），特別是術(shù)后第5天愈合情況比對照組顯著改善；同時，ADMSC組僅1例發(fā)生瘺，對照組5例發(fā)生，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（2=5.33，P ＜ 0.05）。

2.3 病理評估 對照組胃傷口附近大量炎癥細胞浸潤，上皮細胞、肉芽生成和血管再生減少。ADMSC組顯示更少的中性粒細胞浸潤，更多的上皮細胞再生和膠原沉積，特別是術(shù)后第5天更顯著（封二彩圖8）。

2.4 IL-6炎癥因子表達 術(shù)后3及5d，ADMSC組的IL-6陽性細胞區(qū)域占比明顯低于對照組。見表1。

3 討論

ADMSC廣泛存在于脂肪組織中，早期Natesan等[9]研究證實，從重度燒傷患者清除的壞死皮膚組織中，每毫升有活力的皮下脂肪組織能夠分離得到（1.5～2.5）×105個。ADMSC具有定向分化潛能、促進組織和血管再生、抑制炎癥和免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能[10]。本研究提示：從大鼠腹股溝區(qū)脂肪組織提取、分離出ADMSC，具有典型的干細胞相應(yīng)特征；同時，局部注射ADMSC可顯著的降低胃穿孔后縫合傷口的局部炎癥反應(yīng)，減少縫合口瘺的發(fā)生率，促進愈合。

表1 兩組間術(shù)后3及5 d IL-6陽性表達區(qū)域占比 %

ADMSC促進消化道器官損傷修復(fù)的機制復(fù)雜，目前證實其具有“歸巢效益”，指ADMSC定向遷移到特定組織內(nèi)，特別是炎性損傷組織[11]。通過抑制炎癥反應(yīng)、促進組織再生和改善局部微循環(huán)等機制發(fā)揮作用。ADMSC活化分為體內(nèi)活化和體外活化[12]。本研究ADMSC體內(nèi)活化，是通過局部注射ADMSC移植至胃穿孔縫合組組組織周圍，在損傷因子（如IL-6）的刺激下活化并發(fā)揮抗炎、抑制免疫反應(yīng)和組織修復(fù)等功能[13]；因此，ADMSC的體內(nèi)活化很大程度上依賴于組織的損傷程度。本研究也發(fā)現(xiàn)，胃穿孔縫合處術(shù)后3d IL-6顯著升高，急性炎癥反應(yīng)顯著增強，局部注射ADMSC組早期傷口愈合處IL-6比對照組更高，而術(shù)后5 d顯著降低，可能與刺激ADMSC在體內(nèi)活化，從而達到促進組織修復(fù)作用。

綜上所述，本研究模擬的消化道穿孔修復(fù)中，局部注射ADMSC可顯著的降低后期的炎癥反應(yīng)，促進創(chuàng)口的愈合。