鄭潔 趙莉平 胡亞莉

摘要：目的 觀察不同劑量青藤堿對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨中Toll樣受體（TLR）2、4和髓樣分化因子88（MyD88）表達(dá)的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。方法 采用Hulth法建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型。實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為空白組、模型組和青藤堿低、中、高劑量組，空白組不予任何處理，模型組和青藤堿低、中、高劑量組膝關(guān)節(jié)腔分別注射生理鹽水和0.2 mL（5 mg）、0.35 mL（8.75 mg）、0.5 mL（12.5 mg）青藤堿，共干預(yù)10次。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨TLR2、TLR4和MyD88的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果 模型組TLR2、TLR4、MyD88的mRNA和蛋白表達(dá)較空白組均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，青藤堿中、高劑量組TLR2、TLR4、MyD88的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 青藤堿可通過(guò)下調(diào)TLR/MyD88通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)抑制兔膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨免疫反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：青藤堿；骨關(guān)節(jié)炎；固有免疫；Toll樣受體；髓樣分化因子88；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.012

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）09-0049-03

Abstract： Objective To observe the effects of different doses of sinomenine on toll-like receptor （TLR）2， TLR4 and myeloid differentiation factor 88 （Myd88） in cartilage of rabbit knee osteoarthritis model； To discuss its mechanism of action. Methods Knee osteoarthritis model was established by Hulth method. Experimental rabbits were randomly divided into control group， model group， sinomenine low-， medium- and high-dose groups. Blank group received no processing. Model group， sinomenine low-， medium- and high-dose groups received intra-articular injection of normal saline and sinomenine 0.2 mL （5 mg）， 0.35 mL （8.75 mg） and 0.5 mL （12.5 mg） respectively， for 10 times. Real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot were used to detect mRNA and protein expressions of TLR2， TLR4 and MyD88 in cartilage. Results mRNA and protein expressions of TLR2， TLR4 and MyD88 in model group significantly increased compared with control group （P<0.01）； compared with model group， mRNA and protein expressions of TLR2， TLR4 and MyD88 in sinomenine medium- and high-dose groups decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Sinomenine can inhibit the cartilage immune response of rabbit knee osteoarthritis by down-regulating expressions of key molecules in the TLR/MyD88 pathway.

Keywords： sinomenine； osteoarthritis； innate immune； toll-like receptor； myeloid differentiation factor 88； rabbits

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是由增齡及生物力學(xué)機(jī)制改變等因素引起的以關(guān)節(jié)軟骨損傷為中心，并累及病變關(guān)節(jié)周圍多種組織的退行性關(guān)節(jié)病。近年研究發(fā)現(xiàn)，包括炎性反應(yīng)及固有免疫反應(yīng)在內(nèi)的生物學(xué)因素在OA發(fā)病中發(fā)揮了重要作用，OA滑膜炎性反應(yīng)很可能是軟骨損傷激活機(jī)體固有免疫反應(yīng)后出現(xiàn)的繼發(fā)過(guò)程，與OA的發(fā)生與進(jìn)展緊密聯(lián)系在一起[1]。青藤堿是從防己科藤本植物青風(fēng)藤中提取的生物堿單體，為青風(fēng)藤的主要活性成分，具有鎮(zhèn)痛、消炎及免疫抑制等作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可抑制OA滑膜炎性反應(yīng)，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨具有保護(hù)作用[2]。本實(shí)驗(yàn)以“固有免疫參與OA”為切入點(diǎn)，觀察不同劑量青藤堿對(duì)兔膝OA模型關(guān)節(jié)軟骨中Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）2、4和髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）等TLR/MyD88通路中關(guān)鍵分子表達(dá)的影響，從免疫學(xué)角度探討青藤堿干預(yù)OA的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

新西蘭大白兔50只，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.4 kg，西安交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（陜）2014-003。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度45%～60%，正常光照，自由攝食飲水。

1.2 藥物、主要試劑與儀器

正清風(fēng)痛寧注射液（主要成分為鹽酸青藤堿），湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)1607405。β-actin、TLR-2、TLR-4和MyD88引物（南京金斯瑞生物科技有限公司），TLR2、TLR4和MyD88多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），RNA提取試劑盒及qPCR反應(yīng)試劑盒（北京全式金公司）。AB7500熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），濕式轉(zhuǎn)移電泳槽（美國(guó)BioRad公司），NanoDrop 2000C紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司），凝膠成像儀（美國(guó)BioRad公司）。

1.3 造模、分組及給藥

采用Hulth法[3]建立兔膝OA模型，術(shù)后6周隨機(jī)處死2只兔，行關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)檢查，結(jié)果顯示典型軟骨退變，表明造模成功。將50只新西蘭大白兔隨機(jī)分為空白組、模型組和青藤堿低、中、高劑量組，青藤堿低、中、高劑量組膝關(guān)節(jié)腔分別注射正清風(fēng)痛寧注射液0.2 mL（5 mg）、0.35 mL（8.75 mg）、0.5 mL（12.5 mg），模型組注射0.2 mL生理鹽水，以上4組每3 d干預(yù)1次，共干預(yù)10次，空白組不予處理。

1.4 標(biāo)本采集

兔耳緣靜脈空氣栓塞法處死所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，小刀仔細(xì)刮取右膝關(guān)節(jié)面軟骨，一部分保存于裝有RNA保存液的EP管，另一部分置于普通EP管，-80 ℃冰箱保存，分別留待qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)Toll樣受體2、4和髓樣分化因子88 mRNA表達(dá)

用RNA提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定純度和濃度，應(yīng)用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄、合成第一鏈cDNA，最后于熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。操作方法均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。所有qRT-PCR設(shè)4個(gè)復(fù)孔，并設(shè)陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以2–ΔΔCt表示。引物序列見(jiàn)表1。

1.6 Western blot檢測(cè)Toll樣受體2、4和髓樣分化因子88蛋白表達(dá)

將100 mg軟骨提取總蛋白后，以BCA法檢測(cè)定量，計(jì)算上樣量，SDA-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，將一抗用封閉液稀釋并4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌3次，于二抗工作液中室溫孵育1 h，TBST洗滌后加入ECL顯色液中，室溫振蕩，反應(yīng)5 min，暗室中曝光、顯影、定影。使用Image J軟件對(duì)掃描圖像的目的條帶進(jìn)行灰度分析，蛋白表達(dá)水平以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶平均吸光度的比值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組數(shù)據(jù)間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青藤堿對(duì)模型兔軟骨Toll樣受體2、4和髓樣分化因子88 mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組兔軟骨TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，青藤堿中、高劑量組兔軟骨TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表2。

2.2 青藤堿對(duì)模型兔軟骨Toll樣受體2、4和髓樣分化因子88蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組兔軟骨TLR2、TLR4和MyD88蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，青藤堿中、高劑量組兔軟骨TLR2、TLR4和MyD88蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表3、圖1。

3 討論

固有免疫系統(tǒng)的激活主要依賴于對(duì)來(lái)自體內(nèi)病原或損傷組織的保守序列的識(shí)別[4]。OA滑膜炎的發(fā)生機(jī)制與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有相似性，可能是軟骨損傷激活機(jī)體固有免疫反應(yīng)后出現(xiàn)的繼發(fā)過(guò)程[1]。關(guān)節(jié)創(chuàng)傷、長(zhǎng)期過(guò)度使用和增齡均可造成關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，并釋放能夠激活體內(nèi)固有免疫系統(tǒng)的損傷相關(guān)性分子（damage-associated molecular patterns，DAMP）[5]。OA關(guān)節(jié)內(nèi)的DAMP主要有蛋白及蛋白多糖的碎片、細(xì)胞崩解的殘留物[6]。固有免疫受體又被稱為模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRR），PRR通過(guò)識(shí)別DAMP引發(fā)組織無(wú)菌性炎癥。TLR是PRR的一種，除廣泛存在于各類免疫細(xì)胞，TLR還可表達(dá)于OA病變軟骨和滑膜成纖維細(xì)胞[7]。OA患者軟骨損傷區(qū)域TLR2和TLR4的表達(dá)量顯著高于常人[8]。MyD88是TLR信號(hào)通路重要的下游分子，大多數(shù)TLR（TLR3除外）均通過(guò)MyD88途徑激活核因子-κB（NF-κB），引起組織中相應(yīng)炎性介質(zhì)的合成和釋放。青風(fēng)藤來(lái)源于防己科植物青藤或毛青藤的干燥根莖，具有通絡(luò)、止痛、祛風(fēng)濕的功效，主治風(fēng)濕及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)腫大、肢體疼痛、麻木等?，F(xiàn)代藥理研究表明，青藤堿是青風(fēng)藤中主要的活性生物堿，具有祛風(fēng)鎮(zhèn)痛、消炎、免疫抑制、降壓及抗心律失常等作用[9]。文獻(xiàn)報(bào)道，青藤堿可抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血樹(shù)突狀細(xì)胞TLR2/4的表達(dá)及NF-κB的活性，提示其對(duì)TLR/MyD88信號(hào)通路介導(dǎo)的固有免疫具有抑制作用[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兔膝OA模型關(guān)節(jié)軟骨TLR2、TLR4和MyD88的表達(dá)顯著上調(diào)，中、高劑量青藤堿可顯著下調(diào)兔膝OA模型關(guān)節(jié)軟骨中TLR2、TLR4和MyD88的表達(dá)，低劑量青藤堿作用不明顯。這一結(jié)果表明，青藤堿有抑制OA固有免疫反應(yīng)的作用，其機(jī)制與下調(diào)TLR/MyD88信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)相關(guān)。

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（收稿日期：2018-03-21）

（修回日期：2018-04-23；編輯：華強(qiáng)）

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