徐引弟 ，張青嫻 ，王治方 ，朱文豪 ，焦文強 ，李海利 ，郎利敏 ，王克領(lǐng)

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南鄭州450002）

腸外致病性大腸桿菌（（Extraintestinalpathogenic Escherichia coli，ExPEC）是引起世界性疾病的主要病原，可引起各種腸道外疾病，包括新生兒腦膜炎、膿毒癥以及泌尿道疾病，已經(jīng)報道它在歐洲和北美引起動物和人的死亡，ExPEC由于分離部位和遺傳模式而區(qū)分于腸內(nèi)致病性大腸桿菌和共生型大腸桿菌[1-4]。

ExPEC是養(yǎng)豬業(yè)的一個主要病原，引起嚴重的經(jīng)濟損失，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)工業(yè)化的快速發(fā)展，豬ExPEC的暴發(fā)呈上升的趨勢，成了迫切需要解決的問題。而且，人和動物分離的ExPEC分離菌之間的相似性表明，ExPEC存在不同的宿主之間交叉感染的可能性，包括人、伴侶動物、豬和禽類[5-8]。近年來，豬大腸桿菌病的報道日益增多，特別是高致病力ExPEC的報道逐年增多，已經(jīng)給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成重大的損失[9-18]。

本試驗對2017年分離自河南省豬場豬ExPEC進行了毒力試驗和毒力因子的鑒定，并對河南省ExPEC在豬群中的流行現(xiàn)狀、毒力特性等進行研究，旨在為預(yù)防和控制該病的流行提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料及菌株 來自于2017年1—12月河南省養(yǎng)豬場發(fā)生呼吸困難、敗血癥、關(guān)節(jié)炎及神經(jīng)癥狀的發(fā)病及死亡豬的腦、肺、氣管、心血、關(guān)節(jié)液等病料共148份，質(zhì)控菌ATCC25922購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 胰蛋白大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）和胰蛋白大豆肉湯（Tryptic Soy broth，TSB）購自Difco公司。麥康凱瓊脂（Maconkey Agar，MC）購自北京奧博星生物技術(shù)公司。Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒、50×TAE濃縮液購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Taq Mix，DL2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

1.2.1.1 TSA固體培養(yǎng)基 4 g TSA瓊脂粉，溶于100 mL超純水中，115℃滅菌15 min，加胎牛血清5 mL，傾倒平皿。于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 TSB液體培養(yǎng)基 含TSB肉湯粉3 g，溶于100 mL超純水中，115℃滅菌15 min，加胎牛血清5 mL。于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 TSA血平皿 TSA固體培養(yǎng)基滅菌后冷卻至45℃，加脫纖綿羊血5 mL，傾倒平皿。于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4 MC瓊脂平皿 5 g MC瓊脂溶于100 mL超純水中，121℃滅菌15 min，冷卻至45℃，傾倒平皿。于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計 參考文獻[9-10，12-13]，根據(jù)大腸桿菌uid A基因序列設(shè)計引物，用于大腸桿菌的擴增，設(shè)計15個毒力因子包括kpsMTⅡ，kpsMTⅢ，iroN，fyuA，ireA，iutA，papC，papA，fimH，afa，vat，ompA，traT，usp和 ibeA基因的引物，分別用于ExPEC的15個毒力因子的擴增，引物序列如表1所示。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR鑒定所用靶基因及引物

1.2.3 ExPEC的分離鑒定 其參考文獻 [9-10]進行。取病死豬肝臟、肺臟、氣管、心血、關(guān)節(jié)、腦組織等，在無菌條件下，涂布于TSA平板上，置于37℃5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜。在TSA平皿上，挑取疑似菌落于麥康凱平板上，培養(yǎng)12～24 h后，挑取紅色菌落革蘭氏染色。將純化后的疑似菌挑取少量單菌落溶解于30 μL無菌水中，按照Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒操作提取DNA，擴增uid A基因。

1.2.4 致病性試驗 將分離鑒定好的ExPEC接種于不含血清的TSB培養(yǎng)基，37℃250 r/min振搖培養(yǎng)24 h。用生理鹽水稀釋菌數(shù)約為109cfu/mL，腹腔注射小白鼠0.2 mL；同時設(shè)生理鹽水為陰性對照。接種后觀察發(fā)病及死亡情況，剖檢小白鼠，無菌取其心血分離細菌并鑒定。

1.2.5 毒力因子鑒定方法的建立 DNA的提?。喝〖兓蟮木溥m量于50 μL純水的EP管中，按照DNA提取試劑盒說明操作，用表1中15對毒力因子的引物進行擴增。

反應(yīng)體系為 25 μL，其中，2×Taq Mix 12.5 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1 μL，模板 DNA 1 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃1 min，57℃1 min72℃ 30 s，共 35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物4℃保存。取10 μL擴增產(chǎn)物電泳，紫外光下觀察結(jié)果，陽性產(chǎn)物測序。1.2.6 毒力因子的分布 對2017年1—12月分離鑒定的ExPEC進行15個毒力因子的檢測，陽性測序比對，統(tǒng)計毒力因子的分布情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ExPEC的分離鑒定結(jié)果

在TSA平皿上可見到凸起、圓形、光滑、濕潤、不透明、邊緣整齊、直徑2～3 mm的黃色菌落（圖1），在麥康凱平皿上長出玫紅色、光滑的圓形菌落（圖2）。革蘭氏染色為革蘭氏陰性粗桿菌（圖3）。PCR鑒定結(jié)果如圖4所示，在264 bp處有目的條帶，與預(yù)期相符。

2017年1—12月，從河南省35家豬場送檢的病死豬組織148份樣品，一共分離到腸外致病性大腸桿菌52株。

2.2 ExPEC的致病性分析

所有分離鑒定的ExPEC接種小鼠24 h內(nèi)死亡，取死亡鼠心血接種TSA平皿。結(jié)果分離出純的經(jīng)鑒定與ExPEC一致的細菌，證明為ExPEC，其對小鼠有毒力。

2.3 毒力因子PCR鑒定結(jié)果

用ExPEC的15對毒力因子的引物擴增，結(jié)果分別擴增出與預(yù)期大小相符的片段（圖5），測序與GenBank中所有ExPEC毒株的序列同源性均在98%～100%。

2.4 毒力因子的分布

將鑒定好的52株ExPEC進行15個毒力因子的擴增，結(jié)果統(tǒng)計列于表1。毒力基因的流行程度是不同的，其中，ompA，traT基因在所有分離株中都含有，其次為fimH，iutA，vat，iroN，其含量分別為86.5%，67.3%，63.5%，61.5%，最少的是 usp，kpsMTⅢ基因，只有1株。分離體含有的毒力基因最多的有10個（9，40，46號菌），其次含有9個毒力基因（1，18，30，39，51，52 號菌），最少的僅含有 ompA，traT基因（2，3號菌）（表 2，表 3）。陽性結(jié)果測序，同源性均在98%以上。

表2 15個毒力基因在52株ExPEC中的分布

表3 15個毒力基因分布統(tǒng)計

3 結(jié)論與討論

2006年以來，河南省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所傳染病研究室從河南省發(fā)病豬場的豬腸外組織分離出300多株ExPEC，大部分豬場能分離到ExPEC?？梢?，豬ExPEC流行廣，病原復(fù)雜。豬源ExPEC已成為威脅我國養(yǎng)豬業(yè)的主要細菌性疾病之一，2017年分離52株，在豬群的分離率為30%以上[12-13]。

人們已經(jīng)認識到ExPEC的重要性，北美和歐洲報告了許多在牛、人和食物與ExPEC有關(guān)的疾病，可致使不同宿主發(fā)生腦膜炎、敗血癥、泌尿道感染和呼吸道感染。在我國養(yǎng)豬業(yè)中，ExPEC已成為一種常見的致病菌。然而，對ExPEC發(fā)病機制和流行病學(xué)的認識還很有限。JOHNSON等[6-7]提出了一種分子方法，ExPEC中5個毒力標記（PapA/Papc，sfa/foc，afa/dra，iutA 和 kpsMTⅡ）中至少有 2個標記定義為ExPEC。根據(jù)該標準，在本研究的52株菌株中，有22株被鑒定為ExPEC。表明JOHNSON等的標準更嚴格、更有選擇性，且能識別出具有較高致病潛力的菌株。單一的毒力因子并不能決定細菌的致病性[18-23]。因此，本研究篩選出15個主要的毒力相關(guān)基因進行分析，旨在揭示與毒力相關(guān)的基因型性狀。TAN等[10]研究表明，fimH（85.4%），traT（76.8%），iroN（70.2%），iutA（66.7%），fyuA（56.8%）和 kpsMTⅡ（56.8%）在豬ExPEC分離物中非常普遍，所占比例均在50%以上。這與本研究結(jié)果基本一致，而kpsMTⅡ，ibeA，papA，papC 差異較大。ZHU等[9]的研究中，iutA，vat，fimH，traT 和 ompA 比例均在 60%以上，而且ompA在每株菌里均能檢測到，cnf1，focG，ibeA，kpsMTⅢ，afa，hlyD，sfaS，papA 低于 10%，focG未檢測到。這與本研究類似，但本研究中，traA，iroN，papA，afa，fyuA比例比ZHU等的研究結(jié)果高。因此，毒力基因的檢測在不同的研究中比例會有所差異，這可能與分離菌的來源、毒力、地域差異等有關(guān)。由于本研究只進行了小鼠的致死試驗，而沒有測定每一株菌的半數(shù)致死量，因此，每株菌的毒力差異及與毒力基因的分布關(guān)系無法確定，還需進一步研究或收集更多的ExPEC分離物得到驗證。

豬ExPEC病的發(fā)生不同地域間無明顯差異，與季節(jié)關(guān)系較大，冬春季發(fā)病率相對較高，而夏秋季較少，這與氣溫、通風等條件有較大關(guān)系。通過對豬ExPEC的毒力及毒力基因進行研究，為河南省豬ExPEC病的基礎(chǔ)研究、診斷、預(yù)防與控制提供了一定的理論依據(jù)。