韓一超

（山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

副結(jié)核病（paratuberculosis）又稱副結(jié)核性腸炎，是由副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis，MAP）引起的反芻動物的一種慢性消化道傳染病，臨床診斷特征是慢性卡他性腸炎、頑固性腹瀉和逐漸消瘦，剖檢可見腸黏膜增厚形成皺襞[1]。病牛和隱性感染牛不僅糞便中可排出大量病菌，尿和奶中也能排菌。MUTHARIA等[2-3]研究表明，在被MAP感染動物的肝、脾、腎、肺、心臟或生殖器官中也檢測到了副結(jié)核分枝桿菌，其乳肉制品進入了人類的食物鏈，導致人類有感染副結(jié)核病的潛在風險。近幾十年國內(nèi)外大量研究表明，副結(jié)核分枝桿菌可引發(fā)人的克羅恩氏（Crohn's）病[4-5]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物傳染病。副結(jié)核病在1895年報道首例，我國在1975年由吉林農(nóng)業(yè)大學韓有庫等分離出此菌[6]。該病已在全世界分布廣泛，發(fā)病率呈上升趨勢，對養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，僅在美國造成的經(jīng)濟損失就高達200億美元[7-8]。

為了調(diào)查副結(jié)核病在山西地區(qū)奶牛群中的流行情況，本研究在山西地區(qū)開展了對不同規(guī)模奶牛養(yǎng)殖場副結(jié)核病的調(diào)查和抗體檢測，旨在為山西省控制該病提供科學依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 樣品來源

于2016年1—12月，在山西省規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場和個體養(yǎng)殖戶的奶牛群中，隨機抽取牛只，用一次性真空采血管在牛尾根靜脈無菌采血8～10 mL，斜面放置，析出血清后離心分離血清至1.5 mLEP管中，-20℃保存?zhèn)溆?，共采集樣?84份。

1.2 主要試劑

副結(jié)核分枝桿菌抗體檢測ELISA試劑盒，購自美國IDEXX公司。

1.3 方法

用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法進行檢測。本試驗所采用的副結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒是在微量反應板上包被了副結(jié)核分枝桿菌原液提取物，樣品先和草分枝桿菌提取物預孵育，可中和去除其他非特異性抗體。具體操作過程按照試劑盒說明書進行。

1.4 結(jié)果判定

用酶標儀在450 nm波長下測定各孔的OD值。試驗結(jié)果成立的條件為：陽性對照OD450平均值≥0.350，且陽性對照OD450平均值與陰性對照OD450的比值≥3.00。

檢測樣品按照S/P的取值來判斷檢測結(jié)果。

S/P＝（樣品 OD450－陰性對照 OD450）/（陽性對照OD450平均值－陰性對照OD450）×100% （1）

其中，S表示樣品OD450平均值與陰性對照OD450之差，P表示陽性對照OD450平均值與陰性對照OD450之差。當樣品的S/P≥55%時，判定為陽性結(jié)果；當S/P≤45%時，判定為陰性結(jié)果；當45%＜S/P＜55%時，判定為可疑，應該進行重新檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 山西省奶牛副結(jié)核病血清學檢測結(jié)果

對山西省11個地區(qū)的規(guī)?；膛龊蜕B(yǎng)戶的784份血清進行ELISA檢測，結(jié)果顯示，陽性血清202份，陽性率為25.77%（表1）。說明在山西地區(qū)規(guī)模化奶牛場和散養(yǎng)戶的牛群中均存在奶牛副結(jié)核病，副結(jié)核病在山西地區(qū)奶牛群中流行比較嚴重，應引起飼養(yǎng)者和有關部門的重視。

表1 奶牛副結(jié)核抗體檢測結(jié)果

2.2 不同階段奶牛副結(jié)核病抗體檢測結(jié)果

由表1可知，犢牛、育成牛和成年牛的副結(jié)核病陽性率分別為10.34%，29.80%和36.94%。犢牛的副結(jié)核病陽性率低于育成牛和成年牛的副結(jié)核病陽性率。副結(jié)核病陽性率隨著奶牛年齡的增長而升高[9-10]，發(fā)生這種現(xiàn)象可能是由于病牛和隱性感染牛為傳染源，其從糞便、尿和奶中排菌，污染牛舍，犢牛通過吸食含副結(jié)核分枝桿菌的奶或接觸到環(huán)境中的病原菌而感染，導致整個牛群抗體陽性率處于較高的水平。另外，還可能是由于副結(jié)核分枝桿菌感染前期以細胞免疫為主，感染后體液免疫應答才增強，因此，隨著牛年齡的增長，血清學由陰性轉(zhuǎn)為陽性，導致副結(jié)核陽性率升高。成年牛的副結(jié)核病陽性率較高，是因為在采樣時主要采集有副結(jié)核臨床癥狀的牛。

2.3 不同規(guī)模奶牛場副結(jié)核病的檢測結(jié)果

表2 不同規(guī)模奶牛場副結(jié)核抗體檢測結(jié)果

從表2可以看出，在規(guī)?；膛鲋?，副結(jié)核抗體陽性率為16.67%～23.81%；散養(yǎng)戶副結(jié)核抗體陽性率為32.93%。散養(yǎng)戶奶牛的副結(jié)核陽性率比規(guī)?；膛鲫栃月矢?.12～16.26百分點。規(guī)?；膛龈苯Y(jié)核抗體陽性率比散養(yǎng)戶陽性率低，可能是由于規(guī)?；膛瞿膛Ｄ芊秩猴曫B(yǎng)，隔斷了副結(jié)核分枝桿菌由糞便感染犢牛的途徑。

3 結(jié)論與討論

目前，奶牛副結(jié)核病廣泛流行于世界各國，尤其是奶牛養(yǎng)殖業(yè)較發(fā)達的一些國家，如英國、荷蘭、法國等，副結(jié)核病感染率在8%～33%[11-12]。林濤[12]對北京地區(qū)2個規(guī)?；龅?26份血樣進行了副結(jié)核抗體檢測，結(jié)果顯示，陽性率分別為8.5%和32.4%。本研究調(diào)查結(jié)果顯示，山西地區(qū)奶牛副結(jié)核抗體陽性率為25.77%，與國內(nèi)外的調(diào)查基本相符，說明山西地區(qū)奶牛群中副結(jié)核流行嚴重，應引起飼養(yǎng)者和有關部門的重視。

對于牛副結(jié)核病，目前尚無有效的治療方法，檢出、隔離或淘汰感染動物是根除該病的唯一辦法。副結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，奶牛在幼年期感染后會有一個較長的亞臨床期，后期才表現(xiàn)出臨床癥狀，感染前期以細胞免疫為主并伴隨著間歇排菌，經(jīng)過2～5 a的亞臨床期后體液免疫應答增強，同時排菌量明顯增加[13]。對副結(jié)核病的檢測，應針對不同的感染階段，采用不同檢測原理的檢測方法才有可能提高檢出率。由于ELISA方便、成本低，是目前應用最廣泛的檢測方法。在用ELISA篩選出血清陽性牛之后，只有通過糞便抗酸染色，檢測出其中的排菌牛并將其隔離，以阻斷糞口傳播，使犢牛盡可能減少接觸該細菌，才能在牛群中成功地防治該病。