韓一超

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

副結(jié)核?。╬aratuberculosis）又稱副結(jié)核性腸炎，是由副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis，MAP）引起的反芻動(dòng)物的一種慢性消化道傳染病，臨床診斷特征是慢性卡他性腸炎、頑固性腹瀉和逐漸消瘦，剖檢可見(jiàn)腸黏膜增厚形成皺襞[1]。病牛和隱性感染牛不僅糞便中可排出大量病菌，尿和奶中也能排菌。MUTHARIA等[2-3]研究表明，在被MAP感染動(dòng)物的肝、脾、腎、肺、心臟或生殖器官中也檢測(cè)到了副結(jié)核分枝桿菌，其乳肉制品進(jìn)入了人類的食物鏈，導(dǎo)致人類有感染副結(jié)核病的潛在風(fēng)險(xiǎn)。近幾十年國(guó)內(nèi)外大量研究表明，副結(jié)核分枝桿菌可引發(fā)人的克羅恩氏（Crohn's）病[4-5]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物傳染病。副結(jié)核病在1895年報(bào)道首例，我國(guó)在1975年由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)韓有庫(kù)等分離出此菌[6]。該病已在全世界分布廣泛，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，僅在美國(guó)造成的經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)200億美元[7-8]。

為了調(diào)查副結(jié)核病在山西地區(qū)奶牛群中的流行情況，本研究在山西地區(qū)開(kāi)展了對(duì)不同規(guī)模奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)副結(jié)核病的調(diào)查和抗體檢測(cè)，旨在為山西省控制該病提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源

于2016年1—12月，在山西省規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)和個(gè)體養(yǎng)殖戶的奶牛群中，隨機(jī)抽取牛只，用一次性真空采血管在牛尾根靜脈無(wú)菌采血8～10 mL，斜面放置，析出血清后離心分離血清至1.5 mLEP管中，-20℃保存?zhèn)溆?，共采集樣?84份。

1.2 主要試劑

副結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)ELISA試劑盒，購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司。

1.3 方法

用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法進(jìn)行檢測(cè)。本試驗(yàn)所采用的副結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑盒是在微量反應(yīng)板上包被了副結(jié)核分枝桿菌原液提取物，樣品先和草分枝桿菌提取物預(yù)孵育，可中和去除其他非特異性抗體。具體操作過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定

用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的OD值。試驗(yàn)結(jié)果成立的條件為：陽(yáng)性對(duì)照OD450平均值≥0.350，且陽(yáng)性對(duì)照OD450平均值與陰性對(duì)照OD450的比值≥3.00。

檢測(cè)樣品按照S/P的取值來(lái)判斷檢測(cè)結(jié)果。

S/P＝（樣品 OD450－陰性對(duì)照 OD450）/（陽(yáng)性對(duì)照OD450平均值－陰性對(duì)照OD450）×100% （1）

其中，S表示樣品OD450平均值與陰性對(duì)照OD450之差，P表示陽(yáng)性對(duì)照OD450平均值與陰性對(duì)照OD450之差。當(dāng)樣品的S/P≥55%時(shí)，判定為陽(yáng)性結(jié)果；當(dāng)S/P≤45%時(shí)，判定為陰性結(jié)果；當(dāng)45%＜S/P＜55%時(shí)，判定為可疑，應(yīng)該進(jìn)行重新檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山西省奶牛副結(jié)核病血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)山西省11個(gè)地區(qū)的規(guī)?；膛?chǎng)和散養(yǎng)戶的784份血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示，陽(yáng)性血清202份，陽(yáng)性率為25.77%（表1）。說(shuō)明在山西地區(qū)規(guī)模化奶牛場(chǎng)和散養(yǎng)戶的牛群中均存在奶牛副結(jié)核病，副結(jié)核病在山西地區(qū)奶牛群中流行比較嚴(yán)重，應(yīng)引起飼養(yǎng)者和有關(guān)部門的重視。

表1 奶牛副結(jié)核抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同階段奶牛副結(jié)核病抗體檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，犢牛、育成牛和成年牛的副結(jié)核病陽(yáng)性率分別為10.34%，29.80%和36.94%。犢牛的副結(jié)核病陽(yáng)性率低于育成牛和成年牛的副結(jié)核病陽(yáng)性率。副結(jié)核病陽(yáng)性率隨著奶牛年齡的增長(zhǎng)而升高[9-10]，發(fā)生這種現(xiàn)象可能是由于病牛和隱性感染牛為傳染源，其從糞便、尿和奶中排菌，污染牛舍，犢牛通過(guò)吸食含副結(jié)核分枝桿菌的奶或接觸到環(huán)境中的病原菌而感染，導(dǎo)致整個(gè)牛群抗體陽(yáng)性率處于較高的水平。另外，還可能是由于副結(jié)核分枝桿菌感染前期以細(xì)胞免疫為主，感染后體液免疫應(yīng)答才增強(qiáng)，因此，隨著牛年齡的增長(zhǎng)，血清學(xué)由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，導(dǎo)致副結(jié)核陽(yáng)性率升高。成年牛的副結(jié)核病陽(yáng)性率較高，是因?yàn)樵诓蓸訒r(shí)主要采集有副結(jié)核臨床癥狀的牛。

2.3 不同規(guī)模奶牛場(chǎng)副結(jié)核病的檢測(cè)結(jié)果

表2 不同規(guī)模奶牛場(chǎng)副結(jié)核抗體檢測(cè)結(jié)果

從表2可以看出，在規(guī)?；膛?chǎng)中，副結(jié)核抗體陽(yáng)性率為16.67%～23.81%；散養(yǎng)戶副結(jié)核抗體陽(yáng)性率為32.93%。散養(yǎng)戶奶牛的副結(jié)核陽(yáng)性率比規(guī)模化奶牛場(chǎng)陽(yáng)性率高9.12～16.26百分點(diǎn)。規(guī)?；膛?chǎng)副結(jié)核抗體陽(yáng)性率比散養(yǎng)戶陽(yáng)性率低，可能是由于規(guī)?；膛?chǎng)奶牛能分群飼養(yǎng)，隔斷了副結(jié)核分枝桿菌由糞便感染犢牛的途徑。

3 結(jié)論與討論

目前，奶牛副結(jié)核病廣泛流行于世界各國(guó)，尤其是奶牛養(yǎng)殖業(yè)較發(fā)達(dá)的一些國(guó)家，如英國(guó)、荷蘭、法國(guó)等，副結(jié)核病感染率在8%～33%[11-12]。林濤[12]對(duì)北京地區(qū)2個(gè)規(guī)?；?chǎng)的326份血樣進(jìn)行了副結(jié)核抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示，陽(yáng)性率分別為8.5%和32.4%。本研究調(diào)查結(jié)果顯示，山西地區(qū)奶牛副結(jié)核抗體陽(yáng)性率為25.77%，與國(guó)內(nèi)外的調(diào)查基本相符，說(shuō)明山西地區(qū)奶牛群中副結(jié)核流行嚴(yán)重，應(yīng)引起飼養(yǎng)者和有關(guān)部門的重視。

對(duì)于牛副結(jié)核病，目前尚無(wú)有效的治療方法，檢出、隔離或淘汰感染動(dòng)物是根除該病的唯一辦法。副結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，奶牛在幼年期感染后會(huì)有一個(gè)較長(zhǎng)的亞臨床期，后期才表現(xiàn)出臨床癥狀，感染前期以細(xì)胞免疫為主并伴隨著間歇排菌，經(jīng)過(guò)2～5 a的亞臨床期后體液免疫應(yīng)答增強(qiáng)，同時(shí)排菌量明顯增加[13]。對(duì)副結(jié)核病的檢測(cè)，應(yīng)針對(duì)不同的感染階段，采用不同檢測(cè)原理的檢測(cè)方法才有可能提高檢出率。由于ELISA方便、成本低，是目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法。在用ELISA篩選出血清陽(yáng)性牛之后，只有通過(guò)糞便抗酸染色，檢測(cè)出其中的排菌牛并將其隔離，以阻斷糞口傳播，使?fàn)倥１M可能減少接觸該細(xì)菌，才能在牛群中成功地防治該病。