譚 飛，陳 洪，胡紅玲，廖玉華，胡庭興，陳玉鳳，周光良，王 曦

（1.四川農(nóng)業(yè)大學林學院，成都 611130；2.四川省涼山州林業(yè)調(diào)查規(guī)劃設(shè)計院，四川 涼山 615000；3.四川省瀘州市林業(yè)科學研究院，四川 瀘州 646000）

楨楠（Phoebe zhennanS.Lee）為樟科（Lauraceae）楠屬（Phoebe）常綠喬木，是我國特有的珍稀樹種，喜溫暖濕潤氣候，常生長于山麓肥厚腐殖質(zhì)酸性至中性土壤[1]，是國家二級重點保護樹種[2]，其樹姿優(yōu)美，具有很高的觀賞價值，在城市建設(shè)和園林綠化中廣泛栽培。材質(zhì)優(yōu)良，結(jié)構(gòu)細致，紋理光滑、美觀，容易加工，用途廣泛，在建筑裝飾以及家具生產(chǎn)中是貴重的高檔用材[3]。楨楠種苗生產(chǎn)以種子為主，但其自身的繁殖能力和自然更新效率低下[4]，由于種群稀少，種質(zhì)資源有限，野外林下發(fā)芽率不高，成苗率更低，很難見到自然生長的楨楠幼樹，加之長期以來的過度采伐利用，致使我國楨楠資源近于枯竭。而近年來國民經(jīng)濟建設(shè)對楨楠木材的需求又不斷增長，導致其供求矛盾日益加劇[5]。為了保育楨楠種質(zhì)資源，緩解其供求矛盾，有必要充分利用現(xiàn)有技術(shù)條件加速楨楠人工林的發(fā)展，促進楨楠資源的擴大再生產(chǎn)。近年來我們在楨楠苗木生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)普遍存在多胚現(xiàn)象，雖然增加了苗木的總量但降低了幼苗的數(shù)量，增加了苗木規(guī)范化標準化培育的難度，因此有必要探討楨楠種子的發(fā)芽及多胚苗特性及其對多胚苗生長的影響，以滿足生態(tài)環(huán)境建設(shè)和社會經(jīng)濟發(fā)展對楨楠資源的需求。

研究表明，大量被子植物存在多胚現(xiàn)象[6-7]，最早于1719年，（Citrus）[8-9]在柑橘屬植物中發(fā)現(xiàn)了多胚現(xiàn)象。之后在玉米（Zea mays）[10-12]、苧麻（Boehmeria nivea）[13]、韭菜（Alluim tuberosum）[14-15]、咖啡（Coffea liberica）[16]等作物中都發(fā)現(xiàn)了多胚苗，隨后在芒果（Mangifera indica）[17]、黃花風鈴木（Tabebuia chrysantha）[18]等林木上也有過雙胚苗的報道，2000年前后國外也曾有相關(guān)報道[19-20]。目前對楠屬植物多胚現(xiàn)象的研究也有報道，如舒金枝[21]在試驗中首次發(fā)現(xiàn)楨楠存在多苗現(xiàn)象；余道平等[22-23]對細葉楠（Phoebe hui）種子的萌發(fā)特性和幼苗性狀進行了觀測，也發(fā)現(xiàn)其種子存在多胚現(xiàn)象，多胚率達11.1%，其中雙胚苗為8.1%，其余為3胚苗和4胚苗，黃宇[24]研究發(fā)現(xiàn)閩楠（Phoebe bournei）種子的發(fā)芽率和多胚率與其貯藏時間和培養(yǎng)條件都有顯著的相關(guān)性；雖然前人的研究已經(jīng)涉及了楠屬植物多胚苗的報道，但并未涉及楨楠種子多胚率、發(fā)芽率與母樹個體和種粒大小是否存在一定的相關(guān)性以及楨楠多胚苗的生長特性。本研究旨在探討其多胚率的變化規(guī)律、初生多胚苗的生長特性以及對苗木質(zhì)量的影響，以期為優(yōu)良楨楠母樹的確認、種子質(zhì)量控制、優(yōu)良幼苗個體的選擇和提高苗木出圃質(zhì)量提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗區(qū)概況

育苗試驗地設(shè)在雅安市雨城區(qū)四川農(nóng)業(yè)大學科研園區(qū)大棚內(nèi)，位于東經(jīng) 102°59′16″，北緯 29°58′52″，海拔580 m。多年平均氣溫16.2℃，≥10℃的積溫5 231℃，月平均最高溫29.9℃（7月），月平均最低溫3.7℃（1月），年均日照時數(shù)1 039.6 h，無霜期298 d，多年平均降雨量1 774.3 mm，空氣平均濕度79%，屬于亞熱帶濕潤氣候。

1.2 試驗材料

試驗于2014年和2016年分兩次進行，第2次試驗的目的主要是驗證第1次試驗的重復性并補充測定相關(guān)指標，供試的楨楠種子分別于2013年和2015年11月采收。根據(jù)當年母樹開花結(jié)實情況，在雅安市雨城區(qū)小寶洞種群選擇母樹6株，在雨城區(qū)金鳳寺風景區(qū)種群選擇3株，在都江堰市靈巖山種群選擇3株。

各母樹按樹齡組依次編號分別為1、2、3號（雅安市雨城區(qū)小寶洞，60 a生），4、5、6號（都江堰市靈巖山，80 a生），7、8、9號（雅安市雨城區(qū)小寶洞，110 a生），10、11、12號（雅安市雨城區(qū)金鳳寺景區(qū)，150 a生）。其種子粒級劃分為大粒、中粒、小粒，采用稱重法得到不同母樹種子千粒重后，分別將大粒和小粒種子選出達到千粒重1/3為區(qū)分大、中、小粒的標準[25]，共36份材料，每份材料3次重復，每次重復為100粒種子。

育苗基質(zhì)由珍珠巖和蛭石以1∶1比例混合組成。

1.3 種子貯藏與育苗

1.3.1 種子的采集與貯藏

將收集的成熟楨楠種子置于室內(nèi)堆積數(shù)日，待果皮腐爛后，人工揉搓，用清水將種子沖洗干凈，并采用水浮法剔除劣質(zhì)楨楠種子。選出的種子再用洗衣粉水洗凈種子上的油脂，以利其發(fā)芽[21]。洗凈的種子在室內(nèi)陰干后分級，測定各粒級種子的大小規(guī)格和重量，然后將其與干凈河沙按1∶4比例混合均勻進行沙藏，種、沙混合物的濕度保持60%，貯藏于大棚內(nèi)，保持貯藏體透氣和排水良好。

1.3.2 種子育苗

育苗當年3月中旬對苗床進行整理和施肥。后將沙藏的種子取出。以母樹為單元、按其大、中、小不同粒級種子分組播種，每組100粒，重復3次。采用條播法，在已經(jīng)整理好的苗床上按行距10 cm、間距3 cm、深度為5 cm開溝，把種子平放在溝中，蓋土厚度為l～2 cm，播種完后再澆少量水。每3 d觀察種子發(fā)芽情況，并及時補水，用HH2土壤水分測定儀（ML2x，GBR）監(jiān)測苗床含水量，將基質(zhì)體積含水量控制在15%～20%左右（約為試驗用土田間持水量的70%～80%），種子出苗后持續(xù)觀察初生苗生長情況，待幼苗株高達10 cm，單株有3～5片真葉完全打開后（苗齡約90 d）起苗計數(shù)單胚、雙胚至更多胚數(shù)量，檢查多胚苗健康狀況，并測定各類幼苗株高，地徑，然后選擇健康苗移栽至營養(yǎng)袋供進一步觀察。

1.4 指標測定方法

1.4.1 發(fā)芽率測定

在初生幼苗起苗時測定。發(fā)芽率=發(fā)芽的種子數(shù)/播種的種子數(shù)（100粒）×100%

1.4.2 多胚率測定

在初生苗起苗時測定，仍以母樹為單元，按不同粒級種子計算多胚率，并統(tǒng)計單胚率、雙胚率、三胚率及其以上等多胚率，每粒級100粒種子出土的初生苗和未出土的壞芽全部納入計算。同時按形態(tài)大小區(qū)分多胚苗類型，分別記為單胚苗（D）、雙胚大苗（SD）、雙胚小苗（SX）、三胚大苗（TD）、三胚中苗（TZ）、三胚小苗（TX）以及四胚苗各單株的株高、地徑和生物量。多胚率計算如下：

雙胚苗頻率=出現(xiàn)雙胚苗的種子數(shù)/播種的種子數(shù)×100%

三胚苗頻率=出現(xiàn)三胚苗的種子數(shù)/播種的種子數(shù)×100%

四胚苗頻率=出現(xiàn)四胚苗的種子數(shù)/播種的種子數(shù)×100%

多胚苗頻率=雙胚苗頻率+三胚苗頻率+四胚苗頻率

觀測中，未發(fā)現(xiàn)五胚及以上的多胚苗，而四胚苗種子數(shù)量很少且成苗率很低，達不到統(tǒng)計分析的數(shù)量要求，因此未納入統(tǒng)計分析。

1.4.3 幼苗形態(tài)指標測定

幼苗形態(tài)采用直尺測量株高（0.1 cm），電子游標卡尺測量地徑（0.01 mm），地徑從兩個相互垂直的方向測定，取其平均值作為實際地徑，每類幼苗分3組重復，每重測定7株。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件（SPSS Inc.，USA）對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA），并用最小顯著差數(shù)法（LSD法）進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樹齡母樹、不同粒級種子的千粒重

由表1可知，不同楨楠母樹的樹高、胸徑與樹齡呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。12株楨楠母樹種子千粒重均表現(xiàn)為隨粒級的減小而減小，且粒級間呈顯著差異（P＜0.05），這種趨勢也不因樹齡的不同而改變。其中大粒種子千粒重比中粒種子增加了（11.00%～32.11%）、比小粒種子增加了（61.12%～97.81%）。生長環(huán)境一致的3株同齡母樹種子重量之間差異不顯著（P＞0.05），不同樹齡母樹各粒級的種子千粒重量總體上差異顯著（P＜0.05）。由表1還可以看出，80 a生母樹的種子千粒重均值分別超過60、110、150 a生母樹種子30.15%、17.29%、36.26%，其差異達顯著水平（P＜0.05）。表明不同母樹種子的千粒重可能存在隨母樹樹齡變化呈先增后降的趨勢；也有可能是都江堰與雅安兩地的生境不同造成的，也有可能是不同種源的遺傳學特性有差異，使得種子千粒重差異較大。對此還需進行深入的研究。

2.2 不同樹齡母樹及不同粒級種子的多胚率和發(fā)芽率

由表2可知，從60～150 a 4個不同樹齡組的12株楨楠母樹種子都存在多胚現(xiàn)象，均表現(xiàn)為多胚率隨胚數(shù)的增加呈下降趨勢，其中150 a樹齡各母樹間單胚率和雙胚率差異不顯著（P＞0.05），而與三胚率和四胚率以及三胚與四胚率之間差異顯著（P＜0.05）。其他3個樹齡組各胚數(shù)之間多胚率差異均顯著（P＜0.05）；而不同母樹間無論是單胚率還是雙胚率，總體上都表現(xiàn)出顯著的差異，但三胚率和四胚率各母樹間差不顯著。由表2還可看出，多胚率最高達 60.00%（12號母樹，150 a），最低為 6.33%（4號母樹，80 a），而且不同樹齡母樹間多胚率差異顯著，尤其是150 a生母樹與其他樹齡母樹種子單胚率、雙胚率、三胚率、四胚率和多胚率尤為不同，但并沒表現(xiàn)出與樹齡的相關(guān)性，這可能是種源的生境不同或遺傳學特性不同，使得種子多胚率差異較大。

表1 不同樹齡楨楠母樹各粒級種子千粒重Table 1 1000 seed weight of P.zhennan seed trees with different age

表2 不同樹齡楨楠母樹種子的多胚率和發(fā)芽率Table 2 The polyembryo rate and germination rate of P.zhennan seed trees with different age

由表3可知，12株楨楠母樹中除了3號、8號和9號母樹種子多胚率與種子粒級呈現(xiàn)顯著下降的趨勢外，其他母樹種子多胚率與種子粒級無明顯的相關(guān)性；不同母樹不同粒級種子間的發(fā)芽率在92.33%～97.33%之間，且相互之間差異不顯著（P＞0.05），不同樹齡母樹各粒級種子間多胚率也不顯著。由表3還可看出，就多胚率而言，不同母樹之間都表現(xiàn)為雙胚率最大，三胚率次之、四胚率最低。同時多胚率也沒有表現(xiàn)出隨母樹樹齡增加而呈現(xiàn)出規(guī)律性變化的趨勢，同一母樹不同種子粒級間多胚率差異不顯著，表明種子粒級對多胚率影響不顯著。

表3 各楨楠母樹不同粒級種子的多胚率和發(fā)芽率Table 3 The polyembryony rate and germination rate of P.zhennan seeds with different sizes

2.3 種子粒級對多胚初生苗的株高、地徑和生物量的影響

從圖1可知，不同粒級的多胚幼苗的株高和地徑都分別呈現(xiàn)單胚苗＞雙胚大苗≈三胚大苗＞雙胚小苗≈三胚中苗＞三胚小苗的變化規(guī)律，且單胚苗各類指標均顯著高于其他各類幼苗相同指標。其株高分別比其他各類幼苗高出的幅度分別為24.28%～31.84%、28.44%～37.86%、100.54%～117.73%、106.78%～138.91%和137.66%～187.74%；其地徑比其他各類幼苗高出的幅度分別為7.86%～16.52%、10.71%～20.72%、37.17%～65.43%和86.11%～86.74%。幼苗的生長指標分別隨著種子粒級由大到小呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，但大粒和中粒種子的生長指標差異不顯著（P＞0.05），而小粒種子的生長指標則顯著低于大粒和中粒種子。

由圖2可知，隨著多胚苗的胚數(shù)的增加，其根、葉、莖、以及總?cè)旮芍爻尸F(xiàn)顯著（P＜0.05）下降的趨勢。不同粒級的種子幼苗的生長指標隨著多胚數(shù)的增加而降低，表明在多胚幼苗形成階段，其種子自身營養(yǎng)有限，多胚苗越多分配的營養(yǎng)物質(zhì)越少，因此多胚初生苗長勢越弱。不同粒級的種子都是隨著種子千粒重的增加其生長指標呈上升的趨勢，表明種子規(guī)格越大，養(yǎng)分含量越充足，幼苗生長越好。

3 討論

被子植物的多胚苗都起源于相應的多胚種子，且多胚的類型多樣，因而其發(fā)生的機理比較復雜。目前，關(guān)于被子植物多胚苗的發(fā)生機理還沒有形成統(tǒng)一的定論，自1998年黃群策綜合分析被子植物多胚苗發(fā)生機理后，對多胚現(xiàn)象的機制已有多種解釋[26]。馮輝等研究表明，咖啡、韭菜種子的多胚率為4.5%[14，16]，譚志軍等發(fā)現(xiàn)水稻種子多胚率在9.5%～14.4%之間，而用激素處理后可提高到29.4%～38.1%[27]。同時張斯淇等觀察到柑橘育種親本的多胚苗率為3.5%～7.2%，雜交后代可提高到28.0%～44.2%[8-9]。范志忠等發(fā)現(xiàn)甘藍型油菜（Brassica napus）多胚苗高達 85.2%[28]，而莫饒等發(fā)現(xiàn)芒果的多胚苗發(fā)生率更高，其多胚率高達98.9%[17]。楠屬植物種子的多胚現(xiàn)象也很常見，本試驗發(fā)現(xiàn)，參試的所有楨楠母樹都存在多胚現(xiàn)象，其單株多胚率最高達到了60.0%，最低為6.33%，其中包括兩胚、三胚和四胚，但不同母樹都以雙胚率最高。

圖2 楨楠不同類型多胚初生苗的生物量（干重）Figure 2 Biomass of different type of embryo polyembryonic seedling of P.zhennan（dry weight）/g

3.1 不同樹齡楨楠母樹、不同粒級種子對發(fā)芽率和多胚率的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，同一種群同齡母樹之間種子千粒重差異不顯著，而不同樹齡母樹千粒重差異顯著，表明種子千粒重可能隨母樹樹齡的增加存在著先增后減的趨勢；不同粒級楨楠種子千粒重差異顯著，但對其發(fā)芽率和多胚率的影響都不顯著；不同母樹之間種子發(fā)芽率差異不顯著，說明種子發(fā)芽率與母樹個體無關(guān)，而同一種群同齡母樹之間種子多胚率差異顯著，但是不同樹齡（組）母樹之間種子多胚率沒有呈現(xiàn)出規(guī)律性變化，表明楨楠種子多胚率與樹齡沒有相關(guān)性。許方等[29]研究發(fā)現(xiàn)，植株的年齡、年結(jié)實量、植株的營養(yǎng)狀態(tài)和枝條的著生部位等因素對柑橘屬植物的不定胚的發(fā)生數(shù)目有明顯影響。此外，黎垣慶等[30]對水稻API-APIV多胚苗進行遺傳學研究發(fā)現(xiàn)其雙胚苗性狀的表現(xiàn)主要受兩對隱性基因控制，而雙胚苗發(fā)生頻率的高低則受某些修飾因子的影響。因此，我們猜測楨楠種子的多胚率可能與母樹種子形成與發(fā)育過程中受到某些環(huán)境因素影響有關(guān)（如授粉過程、土壤營養(yǎng)條件以及環(huán)境溫度等），也可能與母樹個體的遺傳特性有關(guān)，因而有必要從基因遺傳學的角度來分析其多胚特性的控制與表達，這需要開展進一步的研究。

3.2 不同粒級種子對楨楠多胚幼苗生長指標的影響

有研究表明，在苗期階段苗木的質(zhì)量和出苗的整齊度受種子分級的影響較大，例如，姜景民等[31]對濕地松種子分級育苗后，發(fā)現(xiàn)在生長初期苗木的質(zhì)量隨種粒大小呈正相關(guān)的趨勢；梁機等[32]在研究種粒大小對擎天樹幼苗生長的試驗中也發(fā)現(xiàn)大粒和中粒種子幼苗的苗高、地徑和葉片數(shù)均顯著高于小粒種子相應指標，而大粒和中粒種子幼苗之間的各項生長指標差異不顯著；王志賢等[25]對文冠果種子分級后育苗，發(fā)現(xiàn)分級能顯著提高出苗的整齊度和苗木質(zhì)量，并可經(jīng)濟有效的利用種子。本試驗中，不同粒級的楨楠種子的各項生長指標和生長情況都與上述相關(guān)研究結(jié)果相似，不同的母樹種子千粒重越大其幼苗的各項生長指標越好，且隨著種子粒級的增加，其幼苗生長指標也顯著增加。表明楨楠種子重量越大，貯存的營養(yǎng)物質(zhì)含量越高、活力更強，幼苗具有更佳的生長優(yōu)勢，因此優(yōu)質(zhì)種子是優(yōu)良苗木的基礎(chǔ)，在生產(chǎn)中應首先選擇千粒重更大楨楠母樹種子，或在批量種子選擇的大、中粒種子進行育苗，從而培育出高質(zhì)量的苗木。

本研究還發(fā)現(xiàn)，楨楠多胚苗植株各項生長指標有較大的差異，隨著胚數(shù)增多，其長勢越弱，且多胚苗的株高、地徑、根、莖、葉、總生物重等指標都顯著低于單胚苗，在生產(chǎn)上不能達到優(yōu)質(zhì)合格苗的要求，表明由于種子養(yǎng)分含量有限，發(fā)芽過程中形成的多胚苗健康狀況相對較差，加之在前期育苗的過程中多胚苗之間仍然存在著競爭關(guān)系，雖然幼苗數(shù)量有所增加，但對苗木出圃質(zhì)量有一定的影響，降低合格苗出圃率。譚飛等[33]研究發(fā)現(xiàn)，育苗過程中加強養(yǎng)分管理，每株施復合肥0.2 g可以明顯促進楨楠多胚苗生長，縮小與單胚苗的生長指標的差距，對提高苗木出圃率、降低育苗成本有重要的作用。

綜上所述，在本試驗中，60～150 a樹齡段的楨楠母樹的種子多胚率和發(fā)芽率與母樹的樹齡和種子的粒級的大小沒有顯著的相關(guān)性，不同母樹個體多胚率差異顯著，可能與母樹本身的遺傳特性和環(huán)境條件有關(guān)，但各母樹都呈現(xiàn)出雙胚率最高，三胚率次之，四胚率最低的變化規(guī)律；單胚苗與多胚苗的株高、地徑、根、莖、葉、總重差異顯著，說明多胚率對幼苗的出圃質(zhì)量有較大影響；在生產(chǎn)上應選用千粒重更大楨楠種子，或在批量種子中的選擇大、中粒種子進行育苗，同時，在初生苗移栽過程，只保留單胚苗、雙胚大苗和三胚大苗，可提高出圃苗木的數(shù)量和質(zhì)量。