黃 濤，葉 旭，黃雪麗，李昕昀，梅 猛，余麗萍，鄒 雪，王西瑤

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130）

馬鈴薯是中國(guó)第四大糧食作物，2015年我國(guó)啟動(dòng)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略后，產(chǎn)業(yè)發(fā)展進(jìn)入新的階段。馬鈴薯屬鮮活農(nóng)產(chǎn)品，貯藏過(guò)程中常發(fā)生發(fā)芽、受凍、腐爛、軟縮和變綠等問(wèn)題，導(dǎo)致品質(zhì)下降，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[1]。目前，馬鈴薯主要通過(guò)冷藏恒溫設(shè)施和化學(xué)藥劑處理貯藏，能夠有效降低馬鈴薯貯藏期的損失，但恒溫貯藏庫(kù)建設(shè)成本昂貴，運(yùn)行費(fèi)用高，還存在低溫糖化的問(wèn)題，影響馬鈴薯的加工品質(zhì)。常用馬鈴薯化學(xué)抑芽劑，氯苯胺靈（CIPC）過(guò)量使用存在易殘留，有致癌、致畸和易引起食物慢性中毒等不安全問(wèn)題，并且其破壞薯芽，不能用于種薯貯藏[2]。

植物精油作為純天然提取產(chǎn)物，近年來(lái)以其具有抗氧化活性及抑菌防腐特性被廣泛研究應(yīng)用，在果蔬保鮮方面功效顯著[3-4]。薄荷醇（MEN）是薄荷精油的主要成分之一，是醫(yī)藥中常用的滲透促進(jìn)劑，廣泛應(yīng)用于經(jīng)皮滲透藥物和日常用品如牙膏、香水中，具有抑菌和抗氧化的作用[5]；茉莉精油（JAS）成分復(fù)雜，抑菌抗氧化性強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療和日用化妝領(lǐng)域[6]。但這兩種物質(zhì)在作物上的應(yīng)用，特別是在貯藏保鮮和抑制馬鈴薯發(fā)芽方面，鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)研究薄荷醇和茉莉精油對(duì)馬鈴薯塊莖貯藏中萌芽的影響，探索兩種物質(zhì)作為天然、安全、綠色貯藏抑芽保鮮劑的潛力。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種：馬鈴薯短休眠品種“費(fèi)烏瑞它”，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯研究開(kāi)發(fā)中心提供；薄荷醇購(gòu)自西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；茉莉精油購(gòu)自吉安市國(guó)光香料廠。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

塊莖貯藏及生理指標(biāo)測(cè)定。挑選新鮮收獲的大小均勻，表皮完整，單薯重量50～60 g的馬鈴薯原種塊莖。攤晾于陰涼通風(fēng)處，愈傷處理14 d后進(jìn)行貯藏及試驗(yàn)處理。室溫貯藏（平均氣溫15.9℃，平均相對(duì)濕度84%）。

薄荷醇處理：每處理取薯塊2.5 kg（約40粒），放入體積為5 L的密封紙箱，薄荷醇用量為0.5、1.5、2.5 g，紙箱內(nèi)自然揮發(fā)，分別記為：MEN 0.5 g、MEN 1.5g、MEN 2.5 g。茉莉精油處理：每處理取馬鈴薯塊莖2.5 kg，放入體積為5 L的密封紙箱，茉莉精油用量2.5、5、10 mL，分別記為：JAS 2.5 mL、JAS 5 mL、JAS 10 mL。藥劑裝入10 mL離心管，并用膠帶固定在紙箱壁上。取2.5 kg薯塊不做任何處理作為空白對(duì)照（CK1）和用500 mg/kg CIPC（2.5%的粉劑）噴粉處理作為陽(yáng)性對(duì)照（CK2）。每處理重復(fù)6次，其中3次用于發(fā)芽率測(cè)定、失重率測(cè)定，3次用于內(nèi)部生理生化指標(biāo)測(cè)定。常溫貯藏60 d，每15天取樣一次，每次隨機(jī)取薯塊6個(gè)，取頂芽芽眼部直徑1 cm、深1.5 cm圓柱形用于相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

塊莖頂芽組織形態(tài)觀察。將“費(fèi)烏瑞它”馬鈴薯原原種（新鮮收獲，愈傷處理14 d）每份80粒（每粒5～8 g），裝入5 L的盒里，處理為空白對(duì)照、薄荷醇2 g、茉莉精油10 mL，分別記為CK、MEN 2 g、JAS 10 mL，藥劑放入盒中，自然揮發(fā)，每個(gè)處理重復(fù)3次。在貯藏的第 7、14、21、28、35、42 天，以芽眼為中心取直徑為5 mm馬鈴薯小塊，用FAA（70%乙醇∶乙酸∶甲醛=90∶5∶5）固定 24 h，置于 4 ℃保存。每次取樣均在體視顯微鏡下解剖觀察馬鈴薯頂芽發(fā)芽情況，拍照保存。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 發(fā)芽率測(cè)定

塊莖中出現(xiàn)長(zhǎng)于2 mm的芽定義為發(fā)芽，發(fā)芽率=發(fā)芽薯塊數(shù)/總薯數(shù)×100%。

1.3.2 失重率測(cè)定

失重率=（g1-g2）/g1×100%，g1 為初始?jí)K莖重量，g2為測(cè)定時(shí)薯塊重量。

1.3.3 淀粉含量測(cè)定

淀粉含量測(cè)定采用碘比色法[7]。

1.3.4 還原糖含量測(cè)定

還原糖含量測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸比色法[8]。

1.3.4 淀粉酶活性測(cè)定

淀粉酶活性測(cè)定采用DNS法[8]。

1.3.5 石蠟切片與顯微觀察

石蠟切片制作參考李兵等[9]使用方法并改進(jìn)如下：

固定：將各個(gè)時(shí)期所取的樣品置于FAA固定液中固定至少24 h；.

預(yù)染色、脫水：材料用70%乙醇沖洗兩次，各1 h，然后用1%番紅溶液（70%乙醇配制）預(yù)染色3 d，完全染色后依次置于梯度濃度乙醇中脫水；

透明：透明劑為二甲苯，先用1/2二甲苯進(jìn)行過(guò)渡處理2 h，再用純二甲苯處理2 h；

浸蠟及包埋：將材料中1/4的二甲苯倒出，再在37℃的石蠟∶乙醇=3∶2的混合液體中在處理3 d左右，在56～60℃的恒溫箱中用100%的石蠟連續(xù)處理3次，時(shí)間分別為1 h；

修塊、切片：蠟塊用單面刀片修整，使待切部位呈長(zhǎng)方形或方形，調(diào)整切片厚度為3～4 μm，在Leica RJAS 5ML255型切片機(jī)上進(jìn)行切片；

展片、粘片、烤片：在干燥的載玻片上涂小滴粘片劑，將蠟帶放入40℃蒸餾水中展平，把載玻片放入水中，使蠟帶位于載玻片上，用鑷子輕輕將蠟片放液面上，將此載玻片放置入30℃溫箱中烘干為止，約24 h或35℃約12 h；

脫蠟、復(fù)水、染色：取已烘干的載玻片放入二甲苯（40℃）中脫蠟，8 min，轉(zhuǎn)到1/2二甲苯+1/2乙醇混合液中過(guò)渡約2～3 min，依次浸入100%、95%、85%、70%、60%、50%、30%乙醇、蒸餾水各 2～3 min，再浸入0.025%甲苯胺藍(lán) 1～2 min，蒸餾水洗 2～3 min；

封片、觀察：滴一滴中性樹(shù)膠在材料上蓋好蓋玻片，烘干，切片在ImageA2熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行處理，并用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析。

另外，儀器設(shè)備需具備相關(guān)的使用記錄，醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)經(jīng)常將試驗(yàn)器械與對(duì)照器械同時(shí)進(jìn)行對(duì)照，沒(méi)有記錄就沒(méi)有發(fā)生，醫(yī)療單位有自己的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，日常使用對(duì)照器械都會(huì)有儀器型號(hào)、開(kāi)關(guān)機(jī)時(shí)間、運(yùn)行情況等的詳細(xì)記錄并歸檔；而試驗(yàn)器械也應(yīng)根據(jù)自身試驗(yàn)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)儀器使用記錄表供研究者記錄。對(duì)于體外診斷試劑，也應(yīng)可以溯源其對(duì)應(yīng)的儀器設(shè)備型號(hào)、試驗(yàn)運(yùn)行情況是否正常、使用時(shí)間等記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 塊莖發(fā)芽動(dòng)態(tài)

在常溫貯藏下，薄荷醇處理馬鈴薯在貯藏期間的塊莖形態(tài)及發(fā)芽情況見(jiàn)圖1。貯藏60 d時(shí)，薄荷醇處理馬鈴薯頂芽都出現(xiàn)壞死黑點(diǎn)，未見(jiàn)發(fā)芽。茉莉精油處理馬鈴薯在貯藏期間的塊莖形態(tài)及發(fā)芽情況見(jiàn)圖2。2.5、5.0 mL處理有少許發(fā)芽，芽形態(tài)正常，10 mL處理未見(jiàn)發(fā)芽。

圖1 薄荷醇處理馬鈴薯貯藏期的抑芽情況Figure 1 Bud inhibition of potato in storage period treated with menthol

圖2 茉莉精油處理馬鈴薯貯藏期的抑芽情況Figure 2 Bud inhibition of potato in storage period treated with jasmine oil

根據(jù)塊莖發(fā)芽統(tǒng)計(jì)結(jié)果，由圖3可以看出，CK1在15 d時(shí)發(fā)芽率為55.60%，處理30 d后全部發(fā)芽。經(jīng)CIPC處理的陽(yáng)性對(duì)照CK2在前30 d未發(fā)芽，60 d貯藏期結(jié)束時(shí)，發(fā)芽率為6.70%。薄荷醇、茉莉精油與CK1相比均能降低馬鈴薯發(fā)芽率，3種薄荷醇濃度處理的薯塊均未發(fā)芽，茉莉精油處理濃度越高，發(fā)芽率越低。30 d時(shí)，JAS 2.5 mL和JAS 5 mL處理的薯塊有少量發(fā)芽，JAS 10 mL處理的薯塊在60 d內(nèi)均未萌芽。結(jié)果表明，在常溫條件下，薄荷醇和茉莉精油均能顯著抑制塊莖萌芽。

2.2 不同處理下馬鈴薯芽的生長(zhǎng)

體視顯微鏡觀察空白對(duì)照CK的萌芽過(guò)程見(jiàn)圖4。在貯藏21 d時(shí)即開(kāi)始萌發(fā)（芽長(zhǎng)≥2 mm），在貯藏28 d時(shí)馬鈴薯塊莖全部萌芽。

薄荷醇處理的萌芽過(guò)程見(jiàn)圖5。在7 d時(shí)，塊莖芽眼部位即出現(xiàn)黑色，頂芽干枯，枯點(diǎn)逐漸擴(kuò)大，在處理后期，頂芽周圍的薯肉出現(xiàn)變黑現(xiàn)象，塊莖上其他部位芽眼出現(xiàn)了同樣的壞死。

圖4 空白對(duì)照CK的萌芽過(guò)程Figure 4 The buding sage of CK

圖5 薄荷醇處理后的芽壞死Figure 5 The bud necrosis treated by menthol during storage

茉莉精油處理的萌芽過(guò)程見(jiàn)圖6。在貯藏過(guò)程中，頂芽保持較慢的生長(zhǎng)速度，從扁平到突起經(jīng)歷35 d，到42 d時(shí)，發(fā)芽率為11%，芽的形態(tài)與對(duì)照未見(jiàn)明顯差異。抑芽效果明顯，能有效控制塊莖頂芽的萌發(fā)，與對(duì)照相比能延后馬鈴薯發(fā)芽20 d左右。芽原基未受破壞，在后期貯藏中頂芽和側(cè)芽均能正常萌發(fā)。

2.3 塊莖失重率變化

圖6 茉莉精油處理后的芽變化Figure 6 The change of buds treated by jasmine oil during storage

常溫貯藏條件下，各處理馬鈴薯失重率變化見(jiàn)圖7。馬鈴薯失重率隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而上升。CK1失重率顯著高于CK2及不同濃度薄荷醇和茉莉精油處理。60 d貯藏期結(jié)束時(shí)，CK1的失重率為48.24%，而CK2的失重率為12.01%。薄荷醇處理失重率MEN 1.5 g＜MEN 2.5 g＜CK2＜MEN 0.5 g＜CK1，MEN 1.5 g處理失重率顯著低于CK2處理。茉莉精油處理失重率，JAS 10 mL＜CK2＜JAS 5 mL＜JAS 2.5 mL＜CK1，JAS 10 mL失重率較CK2低1.38%，差異不顯著。結(jié)果表明，常溫貯藏下薄荷醇和茉莉精油處理

圖7 不同濃度薄荷醇（左）和茉莉精油（右）處理對(duì)馬鈴薯失重率的影響Figure 7 Effect of different concentrations of menthol（left）and jasmine oil（right）on weight loss percent of potato

2.4 不同處理對(duì)馬鈴薯淀粉含量的影響

整個(gè)貯藏期內(nèi)，馬鈴薯淀粉含量表現(xiàn)出了先降低（0～30 d）后回升（30～60 d）的變化趨勢(shì)（見(jiàn)圖 8），CK1變化幅度最大，下降最多，在貯藏30 d時(shí)，其中，CK1下降了1.24%，MEN 2.5 g處理僅降低了0.26%。30 d后各處理塊莖淀粉含量逐漸回升。整個(gè)貯藏期，薄荷醇處理淀粉含量 CK1＜CK2＜MEN 0.5 g＜MEN 1.5 g＜MEN 2.5 g，各處理顯著高于CK1。茉莉精油處理 CK1＜JAS 2.5 mL＜JAS 5 mL＜CK2＜JAS 10 mL，隨濃度升高效果越好。貯藏60 d時(shí)，薄荷醇3個(gè)濃度處理、JAS 10 mL的淀粉含量都比CK2高，降低淀粉消耗效果較好。

圖8 不同濃度薄荷醇和茉莉精油處理對(duì)馬鈴薯淀粉含量的影響Figure 8 Effect of different concentrations of menthol（left）and jasmine oil（right）on starch content of potato

2.5 不同處理對(duì)馬鈴薯還原糖含量的影響

2.6 不同處理對(duì)馬鈴薯淀粉酶活性的影響

由圖10可以得知，整個(gè)貯藏期內(nèi)，塊莖的淀粉酶活性表現(xiàn)出了先升高后降低的趨勢(shì)，在45 d時(shí)達(dá)到最大值。薄荷醇處理中，薄荷醇用量越高，淀粉酶活性越低。在貯藏60 d時(shí)，薯塊淀粉酶活性表現(xiàn)出CK1＞CK2＞MEN 0.5 g＞MEN 1.5 g＞MEN 2.5 g，說(shuō)明薄荷醇能顯著抑制淀粉酶的活性。經(jīng)茉莉精油處理的塊莖淀粉酶活性在貯藏期結(jié)束時(shí)，茉莉精油濃度越高淀粉酶活性越低，JAS 10 mL處理貯藏期結(jié)束時(shí)淀粉酶活性最低，顯著低于CK1。

圖9 不同濃度薄荷醇（左）和茉莉精油（右）處理對(duì)馬鈴薯還原糖含量的影響Figure 9 Effect of different concentrations of menthol（left）and jasmine oil（right）on reducing sugar content of potato

圖10 不同濃度薄荷醇（左）和茉莉精油（右）處理對(duì)馬鈴薯淀粉酶活性的影響Figure 10 Effect of different concentrations of menthol（left）and jasmine oil（right）on amylase activity of potato

2.7 石蠟切片觀察不同處理薄壁細(xì)胞中淀粉粒情況

不同處理的薄壁細(xì)胞中淀粉粒分布情況見(jiàn)圖11。薄壁細(xì)胞中淀粉粒主要呈圓形或卵圓形。對(duì)照淀粉粒小，分布較少（圖11a）。薄荷醇處理后的塊莖薄壁細(xì)胞中淀粉粒充實(shí)飽滿分布密集（圖11b）。茉莉精油處理后（圖11c）的馬鈴薯塊莖薄壁細(xì)胞中也含有大量的淀粉粒，與薄荷醇處理相似。

3 討論與結(jié)論

CIPC作為應(yīng)用廣泛的馬鈴薯抑芽劑，會(huì)殺死馬鈴薯塊莖芽分生組織，顯著降低馬鈴薯的重量損失和其生理代謝活動(dòng)，本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究一致[10-12]。本研究中，薄荷醇和茉莉精油兩種新型馬鈴薯抑芽劑處理馬鈴薯塊莖后，馬鈴薯失重率和發(fā)芽率都降低，減少了貯藏中馬鈴薯的損失。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，兩種藥劑處理后馬鈴薯塊莖淀粉含量下降減速，還原糖含量變化幅度縮小，淀粉酶活性較對(duì)照低，石蠟切片也發(fā)現(xiàn)淀粉粒消耗較少，說(shuō)明兩種藥劑都能抑制馬鈴薯生理活動(dòng)水平，并且一定含量的兩種物質(zhì)在多項(xiàng)指標(biāo)上均表現(xiàn)為抑芽效果優(yōu)于CIPC。這種抑芽效果也優(yōu)于其他植物精油在馬鈴薯上的應(yīng)用[13-15]，與濃度和藥劑本身效果可能都有關(guān)系。

本試驗(yàn)對(duì)照頂端分生組織發(fā)育以及淀粉粒變化與文義凱等[16]研究基本一致，但雖使用相同品種，本試驗(yàn)薯塊休眠期約短10 d，可能與株系、薯塊大小和貯藏環(huán)境不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)薄荷醇和茉莉精油處理后的馬鈴薯塊莖萌發(fā)都受到抑制，但是體視顯微觀察推斷兩種物質(zhì)抑制馬鈴薯發(fā)芽的作用機(jī)理不同。薄荷醇處理后7 d，即可觀察到芽生長(zhǎng)錐消失，芽眼部位變黑、干枯，芽形態(tài)畸形，在后續(xù)貯藏中整個(gè)塊莖都無(wú)芽的萌發(fā)，且塊莖薄壁細(xì)胞中淀粉粒含量較多。薄荷醇能夠改變角質(zhì)層細(xì)胞磷脂雙分子層致密結(jié)構(gòu)，增加其流動(dòng)性，從而改變皮層透性[17]，而持續(xù)高濃度的薄荷醇涂抹處理會(huì)導(dǎo)致家兔破損皮膚產(chǎn)生鱗屑和結(jié)構(gòu)變化[18]。馬鈴薯芽眼部位是角質(zhì)層相對(duì)薄弱的位置，持續(xù)暴露在高濃度的薄荷醇環(huán)境下，可能是導(dǎo)致其芽死亡的原因。普紅梅等[15，19]使用濃度20～80 μL/L薄荷精油處理馬鈴薯，發(fā)現(xiàn)濃度越高，抑芽效果越好，未報(bào)道芽是否死亡，可能與其使用精油濃度較低有關(guān)，其認(rèn)為發(fā)揮抑芽作用的是薄荷精油的主要成分香芹酮，由此推斷其使用的精油可能是綠薄荷（Mentha spicataL.）提取的精油，薄荷醇只是其少量組分之一，而非主要成分是薄荷醇的薄荷（Mentha haplocalyxL.）提取的精油。P.Teper-Bamnolker等[20]研究發(fā)現(xiàn)綠薄荷精油及其主要成分R-香芹酮在馬鈴薯抑芽上有相同的效果，30 μL/kg的綠薄荷精油和4.5 μL/L R-香芹酮都會(huì)抑制馬鈴薯萌芽，并且都造成芽的死亡，結(jié)合本試驗(yàn)推斷薄荷精油中的薄荷醇和綠薄荷中的R-香芹酮在馬鈴薯抑芽上有相似的效果。茉莉精油處理的馬鈴薯塊莖休眠期明顯延長(zhǎng)，隨著時(shí)間的推移，部分塊莖開(kāi)始萌發(fā)，相比對(duì)照，芽的生長(zhǎng)出現(xiàn)延緩的現(xiàn)象，但芽形態(tài)正常，頂芽和側(cè)芽均可正常萌發(fā)，未見(jiàn)與對(duì)照明顯差異，可以作為種薯貯藏控芽劑。薄荷醇和茉莉精油處理馬鈴薯后，雖然淀粉、還原糖含量和淀粉酶活性，以及淀粉粒數(shù)量形態(tài)出現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，但從體視顯微觀察結(jié)果推斷其更深層次的作用機(jī)制并不相同。薄荷醇抑制發(fā)芽的癥狀與CIPC相似，都會(huì)導(dǎo)致芽的死亡，推測(cè)它們作用的機(jī)制存在相似之處，但是否薄荷醇也和CIPC一樣，是通過(guò)抑制薯塊芽細(xì)胞紡錘體形成有待進(jìn)一步試驗(yàn)。而茉莉精油的作用，其表現(xiàn)與馬鈴薯自身代謝抑芽物 1，4-二甲基萘（1，4-DMN）相似。M.A.Campbell等[21-22]在對(duì)馬鈴薯抑芽劑CIPC和1，4-二甲基萘的研究中有類似的發(fā)現(xiàn)，CIPC和1，4-DMN處理的馬鈴薯以及休眠狀態(tài)的馬鈴薯，在轉(zhuǎn)錄譜上存在顯著差異，CIPC和1，4-DMN作用機(jī)理不相同，都不是通過(guò)延長(zhǎng)其自然休眠狀態(tài)抑制萌芽，其進(jìn)一步試驗(yàn)表明，1，4-DMN是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期抑制子KRP1和KRP2表達(dá)來(lái)抑制馬鈴薯萌芽。至于薄荷醇和茉莉精油的具體分子機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

薄荷醇和茉莉精油都是天然植物提取物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、日用化妝品，未有報(bào)道對(duì)人體危害和使用殘留限定，安全性高，而CIPC因其毒性及環(huán)境危害，各國(guó)都有嚴(yán)格殘留限定[23]。同時(shí)，CIPC抑芽效果不可逆，不能應(yīng)用于種薯貯藏，在此點(diǎn)上，茉莉精油的可逆控芽有明顯優(yōu)勢(shì)，可用于種薯控芽劑開(kāi)發(fā)。薄荷醇原料易得，價(jià)格與CIPC相差不大，在馬鈴薯新型抑芽劑上有較大應(yīng)用前景，適合用于商品薯貯藏藥劑開(kāi)發(fā)。

常溫貯藏條件下，薄荷醇和茉莉精油均能有效抑制塊莖發(fā)芽，降低淀粉酶活性、還原糖含量，保持馬鈴薯塊莖中淀粉含量，減少塊莖重量損失，保持了馬鈴薯的貯藏品質(zhì)和良好的商品性。薄荷醇處理會(huì)造成馬鈴薯芽死亡；茉莉精油能有效抑制芽生長(zhǎng)，不破壞芽原基，芽的后期生長(zhǎng)正常。因此，薄荷醇適用于商品薯的貯藏藥劑開(kāi)發(fā)，茉莉精油既可用于商品薯的貯藏藥劑開(kāi)發(fā)，亦可用于種薯的貯藏藥劑開(kāi)發(fā)。