肖全偉，吳文林，劉玲利

（1.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，成都 610100；2.成都理工大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，成都 610059）

真菌毒素是真菌在適宜環(huán)境下生長(zhǎng)產(chǎn)生的毒性次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)動(dòng)物和人類(lèi)有遺傳毒性、致癌和致畸性，同時(shí)還會(huì)引起肝腎中毒、生殖系統(tǒng)異常以及抑制免疫反應(yīng)等，對(duì)人類(lèi)身體健康造成嚴(yán)重威脅[1]，其中黃曲霉毒素屬于極毒類(lèi)，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）劃定為一類(lèi)致癌物。

真菌毒素的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[2-3]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4-6]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-9]等。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性，適用于真菌毒素的快速檢測(cè)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法樣品檢測(cè)前常需衍生化處理，在一定程度上受到限制；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法擁有液相色譜高效的分離技術(shù)以及質(zhì)譜高分辨率的檢測(cè)能力，具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、特異性和選擇性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠快速、有效同時(shí)測(cè)定多種真菌毒素，是目前開(kāi)發(fā)在復(fù)雜基體樣品中同時(shí)測(cè)定多種真菌毒素的良好方法。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)小麥等原糧中真菌毒素的含量高度重視，發(fā)達(dá)國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法中涉及真菌毒素的種類(lèi)較多，且限量標(biāo)準(zhǔn)比較苛刻。我國(guó)現(xiàn)行的真菌毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法常只測(cè)定單一或少數(shù)幾種真菌毒素，檢測(cè)效率較低。為此，開(kāi)發(fā)建立與國(guó)際接軌的小麥等原糧中多種真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)方法顯得十分必要。

QuEChERS技術(shù)首先由M.Anastassiades等[10]于2003年在測(cè)定蔬菜和水果中的農(nóng)藥殘留時(shí)建立，現(xiàn)被廣泛用于動(dòng)植物源性食品、土壤、化妝品、中藥等基質(zhì)中的獸藥、農(nóng)藥殘留或非法添加物等測(cè)定[6，9，11-16]，具有待測(cè)物回收率高、應(yīng)用范圍廣、分析速度快、污染小和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。本文對(duì)QuEChERS前處理技術(shù)條件進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，研究建立了采用HPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定8種真菌毒素的高通量檢測(cè)和確證方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀：日本SHIMADZU公司；API 4000 Q Trap質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源（ESI）：美國(guó)ABI公司；振蕩器：德國(guó)Heidolph公司；高速離心機(jī)：美國(guó)BECKMAN公司；N-EVAP水浴氮吹儀（美國(guó)OA公司）；Milli-Q超純水器：美國(guó)Millipore公司。

1.2 試劑與試材

黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素G2（AFG2）、T-2毒素（T-2）、HT-2毒素（HT-2）：購(gòu)自 Trilogy Analytical Laboratory，其中 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的濃度為 25 μg/mL，T-2、HT-2 的濃度為 100 μg/mL；二乙酸熏草鐮刀菌烯醇（DAS）、赭曲霉毒素A（OTA）：購(gòu)自Fermentek，純度＞99%。乙腈和甲醇（色譜純）：美國(guó)Honeywell公司；甲酸及甲酸銨（色譜純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；十八烷基硅烷鍵合相硅膠（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷鍵合相硅膠（PSA）、石墨化碳（GCB）和氨基鍵合相硅膠（NH2）均購(gòu)自美國(guó)Agilent公司；硫酸鎂和氯化鈉（分析純）：成都市科龍化工試劑廠。試驗(yàn)所用水均為Milli-Q超純水。所收集的15份小麥樣品均來(lái)自農(nóng)戶。

分別稱取DAS和OTA固體標(biāo)準(zhǔn)品各1 mg，用乙腈配制濃度為100 μg/mL的單標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于-18℃?zhèn)溆谩?/p>

分別移取適量8種真菌毒素單標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈稀釋并定容，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18℃儲(chǔ)存。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取不含8種待測(cè)物的小麥樣品，按1.3.2節(jié)方法操作，得到空白基質(zhì)溶液。用空白基質(zhì)溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成一系列混合基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，且現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品制備

分別取有代表性的樣品500 g，四分法縮減至少100 g，粉碎，混合均勻后裝入樣品密封袋中于-18℃避光保存，防止樣品受污染和變質(zhì)，以備用。

1.3.2 樣品提取與凈化

稱取2.0 g（精確至0.001 g）制備樣品于50 mL帶螺旋蓋離心管中，加入8 mL 0.3%甲酸水溶液并在高速均質(zhì)器中均質(zhì)30 s，振蕩15 min，加入10 mL乙腈，渦旋振搖30 min后加入1.5 g硫酸鎂和0.5 g氯化鈉固體，劇烈振搖 2 min 后，離心 3 min（5 000 r/min）。移取離心后上層有機(jī)相2 mL至另一支10 mL具塞離心管中，加入150 mg無(wú)水硫酸鎂，150 mg C18和20 mg PSA吸附劑后，旋緊螺旋蓋，立即高速渦旋混合1 min，然后于4℃下離心1 min（4 000 r/min）。離心后全部上清液于水?。?5±1）℃下氮?dú)獯蹈桑?0%乙腈水溶液溶解濃縮物并定容至1.0 mL，渦旋混合 1 min后離心 5 min（15 000 r/min），留取上清液待測(cè)。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters C18柱（5 μm，150 mm×4.6 mm i.d.）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相：A-甲醇；B-含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨水溶液。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源（ESI+）；電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度550℃；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式（MRM）；8種待測(cè)物的去簇電壓（DP）及碰撞能（CE）、定性和定量離子對(duì)等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

1.4.3 樣品測(cè)定

取適量樣品溶液和相應(yīng)的基質(zhì)匹配工作溶液系列，分別上LC-MS/MS測(cè)定，外標(biāo)法定量，若樣液中待測(cè)物濃度超出工作曲線范圍，需稀釋后再測(cè)定。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析

回收率與精密度等數(shù)據(jù)在Microsoft Excel 2007版軟件上進(jìn)行分析。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The program of gradient elution

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別將濃度為0.5 μg/mL的8種真菌毒素單標(biāo)準(zhǔn)溶液直接通過(guò)針泵進(jìn)樣方式優(yōu)化質(zhì)譜條件。先在全掃描方式中優(yōu)化各種真菌毒素的母離子信號(hào)，選擇信號(hào)最強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰作為母離子。由于串聯(lián)質(zhì)譜的靈敏度較大程度上依賴于化合物在全掃描模式中的響應(yīng)，因此需盡可能地優(yōu)化全掃描質(zhì)譜信號(hào)。然后通過(guò)選擇離子掃描模式和子離子掃描模式優(yōu)化子離子、碰撞能和碰撞氣體，分別選擇豐度較大的兩個(gè)碎片離子為檢測(cè)定性子離子，其中豐度最大的為定量子離子。優(yōu)化的主要質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 8種真菌毒素的主要質(zhì)譜參數(shù)Table 2 The MS/MS parameters of 8 mycotoxins

2.2 色譜條件的優(yōu)化

圖1 8種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Figure 1 The MRM chromatogram of eight mycotoxins

在正離子模式下，流動(dòng)相呈酸性有助于提高各種待測(cè)物在質(zhì)譜中的離子化效率，為獲得最佳分辨率和靈敏度，比較甲酸水溶液和乙酸水溶液對(duì)待測(cè)物測(cè)定的效果。結(jié)果表明，在ESI+模式下，以添加0.1%甲酸的甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)的色譜分離和離子化效果較好，同時(shí)添加適量的甲酸銨有利于待測(cè)物的色譜分離。為此，本研究采用甲醇-含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨水溶液為ESI+模式的流動(dòng)相。優(yōu)化的梯度洗脫程序見(jiàn)表1。8種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 QuEChERS條件優(yōu)化

2.3.1 提取劑的種類(lèi)及用量

QuEChERS方法中常用的提取劑有乙腈、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷等。由于原糧中水分含量較低，需加水充分浸潤(rùn)混合均勻后再進(jìn)行溶劑提取。在選擇提取劑時(shí)應(yīng)該考慮溶劑的極性，其既能與水互溶從而滲透到樣品內(nèi)部，同時(shí)通過(guò)鹽析作用后又能與水分離。乙酸乙酯作為提取劑時(shí)回收率低；丙酮、甲醇是良好的提取劑，但其共萃取物較多且不易與水分離；二氯甲烷、三氯甲烷可溶解色素，而且對(duì)人體毒性強(qiáng)。乙腈具有上述要求的溶劑性質(zhì)，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)、脂肪和糖的溶解性較小，提取效果好。因此，根據(jù)8種真菌毒素的性質(zhì)和樣品的基質(zhì)特性，選擇乙腈作為提取劑。

取一定量的陰性小麥樣品，加入已知量的8種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻，制成陽(yáng)性樣品。分別取2 g制備的陽(yáng)性樣品，考察不同乙腈用量對(duì)8種待測(cè)物回收率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明隨乙腈用量的增加，8種真菌毒素的回收率相應(yīng)提高。當(dāng)提取劑體積為8 mL時(shí)，其回收率均小于70%，未達(dá)到分析要求；當(dāng)提取劑體積為10 mL時(shí)，其回收率接近90%，可滿足分析要求；當(dāng)繼續(xù)增加提取劑用量時(shí)，其回收率增加不明顯。因此，考慮溶劑使用量及環(huán)保要求，確定提取劑乙腈用量為10 mL，見(jiàn)表3。

表3 乙腈用量試驗(yàn)Table 3 Selection of the amount of acetonitrile

2.3.2 樣品水溶液中添加酸種類(lèi)及用量

采用酸性水溶液浸潤(rùn)樣品能使樣品保持較低pH值，進(jìn)而抑制待測(cè)物的離子化使其更易溶于有機(jī)相，以達(dá)到增高提取效率和保持穩(wěn)定回收率的目的。常用的酸有甲酸和乙酸，其效果相近，本試驗(yàn)選用甲酸。

分別稱取2 g制備的含8種真菌毒素的小麥樣品，考察不同濃度的甲酸對(duì)其回收率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨甲酸濃度增加，8種真菌毒素的回收率變化不明顯，均在80%以上，可滿足分析要求（見(jiàn)表4）。為保證方法具有較強(qiáng)的耐受性，確定水中添加甲酸的濃度為0.3%。

表4 甲酸濃度選擇Table 4 Selection of the concentration of formic acid

2.3.3 提取時(shí)間

分別考察提取時(shí)間為 5、10、20、30、60 min 時(shí)對(duì)8種真菌毒素回收率的影響。為縮短提取時(shí)間，同時(shí)提高提取效率，試驗(yàn)采用渦旋振搖提取方式。隨提取時(shí)間增加，8種真菌毒素的回收率相應(yīng)提高。當(dāng)提取時(shí)間為20 min時(shí)，其回收率在82.1%～89.4%之間；在30 min時(shí)，其回收率在89.5%～99.1%之間，滿足分析要求；當(dāng)進(jìn)一步增加提取時(shí)間時(shí)，其回收率變化均不明顯，趨于穩(wěn)定（見(jiàn)表5）。因此，選擇合適的振搖提取時(shí)間為30 min。

表5 提取時(shí)間選擇Table 5 Selection of extraction time

2.3.4 鹽析劑的種類(lèi)及用量

通過(guò)加入適量的鹽析劑使水相和有機(jī)相分層，因而引起的有機(jī)相極性變化可使極性范圍更寬的待測(cè)物進(jìn)入有機(jī)相中，有效提高提取效率。QuEChERS方法中常用的鹽析劑有氯化鈉、硫酸鎂、乙酸鈉等。本研究采用的鹽析劑為0.5 g氯化鈉和1.5 g無(wú)水硫酸鎂。

2.3.5 凈化吸附劑種類(lèi)及用量

QuEChERS技術(shù)中用于凈化的吸附劑主要有：十八烷基硅烷鍵合相硅膠（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷鍵合相硅膠（PSA）、石墨化碳（GCB）、氨基鍵合相硅膠（NH2）等。這幾種吸附劑具有各自的特點(diǎn)，也具有一定的共性。由表6可知，C18粉末作為吸附劑效果最好，本試驗(yàn)初步選定C18粉末作為吸附劑，無(wú)水硫酸鎂（magnesium sulfate anhydrous，MSA）用于除去凈化樣液中少量的水分。但從凈化液顏色看還有色素雜質(zhì)，會(huì)污染質(zhì)譜系統(tǒng)，還有可能導(dǎo)致較嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)。由于小麥等原糧樣品基質(zhì)較復(fù)雜，盡管PSA對(duì)待測(cè)物有不同程度的吸附，但它具有良好的除色素雜質(zhì)及脂類(lèi)性能，恰當(dāng)?shù)亟M合使用吸附劑可以達(dá)到最好的凈化效果。因此本試驗(yàn)嘗試加入少量PSA，與C18粉末一起組成吸附劑組合，以期達(dá)到既不損失回收率，又能達(dá)到徹底凈化樣液的目的。通過(guò)試驗(yàn)（見(jiàn)表7、表8），本研究選擇的吸附劑種類(lèi)和用量分別為150 mg C18、20 mg PSA。

表6 吸附劑選擇Table 6 Selection of adsorbent（n=2）

表7 C18吸附劑用量選擇（n=2）Table 7 Selection of the amount of C18（n=2）

表8 PSA吸附劑用量選擇（n=2）Table 7 Selection of the amount of PSA（n=2）

此外，還對(duì)無(wú)水硫酸鎂的用量進(jìn)行了考察。按“1.3.2”節(jié)進(jìn)行樣品處理。加入150 mg C18粉末和25 mg PSA，再分別加 100、150、200、250、300、400 mg無(wú)水硫酸鎂于2 mL上清液中，余下按步驟操作。分別計(jì)算其回收率，試驗(yàn)結(jié)果表明隨無(wú)水硫酸鎂加入量增加，回收率變化不大，但加入量超過(guò)250 mg，回收率有較明顯偏低，可能是無(wú)水硫酸鎂具有良好吸水性，用量過(guò)大導(dǎo)致待測(cè)物回收降低。因此本試驗(yàn)選擇無(wú)水硫酸鎂加入量為150 mg。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)影響

基質(zhì)效應(yīng)是指被分析樣品中除待測(cè)物以外的基質(zhì)組分對(duì)待測(cè)物分析的干擾和測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，是由共流出物影響電噴霧接口處待測(cè)物離子化效率所致，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制和基質(zhì)增強(qiáng)兩種，其中基質(zhì)抑制較為多見(jiàn)。本研究采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法考察基質(zhì)效應(yīng)（ME），將繪制得到小麥樣品的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果表明，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率小于標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，即存在基質(zhì)抑制效應(yīng)（ME：AFB10.78、AFB20.69、AFG10.81、AFG20.75、OTA 0.92、T-2 0.83、HT-2 0.78、DAS 0.82）。本方法采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，可以減小基質(zhì)效應(yīng)，以達(dá)到檢測(cè)分析要求。

2.5 線性關(guān)系、方法檢出限和定量限

在優(yōu)化條件下用HPLC-MS/MS測(cè)定配制的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各種真菌毒素濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，得到的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限（以S/N≥3計(jì)）和方法定量限（以 S/N≥10計(jì)）見(jiàn)表 9。在 0.05～200 μg/L范圍內(nèi)，8種真菌毒素方法的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于 0.99，方法檢出限為 0.10～1.0 μg/kg，定量限為 0.25～2.8 μg/kg。

表9 8種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 9 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients，LODs and LQDs of eight mycotoxins

2.6 回收率與精密度

選用空白小麥樣品進(jìn)行3個(gè)不同濃度水平（定量限、2倍定量限、5倍定量限）的8種混合真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)加標(biāo)回收試驗(yàn)，在每個(gè)加標(biāo)水平下分別選取6個(gè)平行樣，8種真菌毒素的平均回收率為85.1%～95.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%～8.5%，符合痕量分析要求?；厥章逝c精密度數(shù)據(jù)見(jiàn)表10。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

采用該方法測(cè)定了收集的15份小麥樣品，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表11。由表11可以看出，OTA、T-2毒素的檢出率較高，分別為33.3%、46.7%，含量分別為1.55～3.45 μg/kg，2.67～70.4 μg/kg。

3 討論與結(jié)論

將本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果與我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 2761-2017）中列出的真菌毒素最大允許限量值比較（黃曲霉毒素B1≤5.0 μg/kg、赭曲霉毒素A≤5.0 μg/kg），都符合標(biāo)準(zhǔn)限量要求，表明所采集的小麥樣品受黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A等污染情況較好。結(jié)合國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)[17-18]，小麥普遍受到赤霉病菌等真菌侵染?？紤]到小麥及其制品的消費(fèi)量大，下一步課題組將拓展檢測(cè)項(xiàng)目種類(lèi)（比如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、玉米赤霉醇等），增大檢測(cè)樣品量，較全面客觀反映四川地區(qū)乃至全國(guó)內(nèi)大宗糧食類(lèi)的真菌毒素污染情況，以便制定切實(shí)可行的監(jiān)測(cè)及防控計(jì)劃。

本文建立的小麥中8種真菌毒素檢測(cè)方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、可靠、環(huán)保等特點(diǎn)，補(bǔ)充了原糧中多種真菌毒素定量確證檢測(cè)方法，可以為原糧質(zhì)量安全的管理和控制提供技術(shù)支持。

表10 小麥樣品中8種真菌毒素的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 10 Recoveries and RSDs for eight mycomycotoxins

表11 實(shí)際樣品測(cè)定Table 11 Determination of real samples