范亞莉,王娟紅,魏 威,方航榮,段 瑛,李娜苗,張瑩瑩,李建英

(1西安市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科,西安 710003;2延安大學醫(yī)學院;3西安市第三醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:657237987@qq.com)

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。甲狀腺癌中80%-85%為甲狀腺乳頭狀癌(PTC)[1]。PTC好發(fā)于中、青年女性,大多數(shù)患者預后良好,然而,部分患者仍存在復發(fā)、轉(zhuǎn)移、甚至因癌死亡的風險[2-4]。近年來,全世界范圍內(nèi),PTC發(fā)病率顯著上升,部分患者還表現(xiàn)為甲狀腺內(nèi)的多發(fā)癌。研究PTC病因及發(fā)病機制,尋求除手術(shù)治療、I131治療以外其他潛在的新的治療方案對于預防及治療PTC,提高PTC患者預后具有重要意義。

Ku80是Ku70/Ku80異源二聚體的組成單位,廣泛存在于哺乳動物細胞內(nèi),在非同源末端連接(NHEJ)DNA修復中具有重要作用。Ku80可以與斷裂的DNA雙鏈末端結(jié)合,吸引DNA依賴性蛋白激酶并引發(fā)NHEJ途徑的DNA修復[5]。Ku80除了具有DNA修復作用之外,還涉及其他細胞過程,包括端粒維持、抗原受體基因排列、細胞周期調(diào)節(jié)、集落形成和細胞凋亡等[6]。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)Ku80蛋白的活性與某些惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關[7]。本課題組在前期研究中,通過免疫組化實驗也發(fā)現(xiàn)人甲狀腺乳頭狀癌組織中Ku80蛋白高水平表達,而且發(fā)現(xiàn)Ku80的表達與腫瘤TNM分期中腫瘤T分期相關。本次研究擬在細胞水平上,進一步研究Ku80基因及其表達在PTC中的作用。我們檢測PTC癌細胞株K1及B-CPAP細胞中Ku80的mRNA表達水平,并應用CRISPR/Cas9敲減技術(shù),研究Ku80對PTC癌細胞生物學功能,包括增殖、凋亡、侵襲和克隆形成能力等的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

甲狀腺乳頭狀癌細胞株K1(購自European Collection of Cell Cultures,ECOCC)維持在補充有10%胎牛血清的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基中,甲狀腺乳頭狀癌B-CPAP細胞株(購自中科院上海細胞庫)維持在補充有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中(美國,Gibco公司)。Ku80兔抗人一抗購自美國Cell Signaling公司。胎牛血清FBS購自澳洲Ausbian公司、DMEM培養(yǎng)基購自美國Cornning公司、胰蛋白酶購自上海化學試劑公司。CRISP/CAS9雙載體慢病毒購自上海吉凱基因有限公司,且由該公司完成CRISP/CAS9雙載體慢病毒包裝并測序驗證。Lipofectamine2000購自美國invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR技術(shù)檢測Ku80在不同細胞株中的表達 ①總RNA的提取:使用Trizol試劑盒在K1、B-CPAP細胞中提取總RNA,Nanodrop 2000/2000C分光光度計分析測定所抽提RNA的濃度及質(zhì)量。②cDNA的合成:取2 μg總RNA,1 μl Oligo dT(0.5 μg/μl),1 μl M-MLV-RTase(200 U/μl),于42 ℃水浴反應1 h,70 ℃水浴10 min獲取cDNA。內(nèi)參基因和目的基因引物由吉凱基因設計和合成(上下游引物信息見表1,GAPDH為內(nèi)參引物)。③PCR反應:以同一cDNA為模板,在20 μl反應體系內(nèi)擴增。反應條件:95 ℃預變性5 min后,95 ℃ 50 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,循環(huán)35次，最后72 ℃延伸7 min。取5 μl PCR產(chǎn)物于1.8%瓊脂糖凝膠電泳(80 V,30 min),凝膠成像儀分析RT-PCR產(chǎn)物帶的積分吸光度值。用XRCC5/GAPDH擴增量表示細胞的相對表達水平(Ku80亞單位由XRCC5編碼,故Ku80又稱XRCC5)。

表1 目的基因與內(nèi)參基因的上下游引物序列Table 1 Upstream and downstream primer sequences of the target gene and the internal reference gene

1.2.2 CRISP/CAS9系統(tǒng)慢病毒包裝 由上海吉凱基因有限公司設計三條小向?qū)NA(small guide RNA,sgRNA)靶點序列。根據(jù)目的基因設計的sgRNA序列分別為:5′-GTCATAAGCATATCGAACTA-3′,5′-TCATATCAAGCATAACTATG-3′及5′-GGTTCAGAGAAGATTCTTCA-3′,根據(jù)sgRNA序列設計PCR引物,以基因組為模板擴增,對產(chǎn)物進行PCR測序。結(jié)果顯示:sgRNA處不存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點,可進行細胞感染。CRISP/CAS9系統(tǒng)(購買自上海吉凱基因有限公司)慢病毒包裝由上海吉凱基因有限公司完成并測序驗證。

1.2.3 細胞感染 ①培養(yǎng)狀態(tài)良好的K1及B-CPAP細胞鋪板(6孔板),進行Puromycin抗體標記的Cas9-Puro慢病毒感染。K1細胞實驗用病毒滴度為2×108TU/ml,病毒用量10 μl;感染條件為Eni.S+polybrene(Enhanced Infection Solution+polybrene,感染增強劑和助感染試劑),感染復數(shù)(MOI)為10,感染后16 h換液,72 h拍照。感染后72 h加入Puromycin處理(Puromycin工作終濃度為4.00 μg/ml,維持濃度2.00 μg/ml)篩選。B-CPAP細胞實驗用病毒滴度為2×108TU/ml,病毒用量5 μl;感染條件為Eni.S+polybrene,MOI為5,感染后16 h換液,72 h拍照。感染后72 h加入Puromycin處理(Puromycin工作終濃度2.00 μg/ml,維持濃度1.00 μg/ml)篩選。篩選后得到穩(wěn)定表達CAS9的混合克隆細胞株:CAS9-K1及CAS9-B-CPAP。②培養(yǎng)狀態(tài)良好的穩(wěn)定表達CAS9的CAS9-K1及CAS9-B-CPAP細胞鋪板,進行LV-Ku80-sgRNA慢病毒感染。CAS9-K1細胞實驗用病毒滴度為1×109TU/ml,病毒用量1 μl;感染條件為Eni.S+polybrene,MOI為10,感染后16 h換液,72 h拍照。CAS9-B-CPAP實驗用病毒滴度為3×108TU/ml,病毒用量3.3 μl;感染條件為Eni.S+polybrene,MOI為5,感染后16 h換液,72 h拍照。

1.2.4 Cruiser酶切檢測CAS9-sgRNA活性 收集培養(yǎng)狀態(tài)良好的CRISPR/CAS9處理后的細胞株K1及B-CPAP(感染7 d后收集細胞檢測),用基因組DNA提取試劑盒抽提樣品基因組,按照設計的PCR擴增引物(包含切割靶點),在50 μl反應體系中(上、下游引物各1 μl,2×Taq Plus Master Mix 25 μl,Genomic DNA 2 μl,ddH2O21 μl)進行PCR反應(95 ℃ 2 min變性,95 ℃ 20 S,75 ℃ 20 S,72 ℃ 30 S,35循環(huán)擴增,72 ℃ 5 min延伸,95 ℃ 5 min變性),獲得雜交DNA產(chǎn)物。在滅菌PCR管中配置10 μl反應體系(PCR產(chǎn)物2-3 μl,Detecase Buffer 2 μl,Detecase 1 μl,Add ddH2O至10 μl),45 ℃反應20 min后,立即向上述10 μl體系內(nèi)加入2 μl終止液,然后進行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 全自動蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)檢測經(jīng)CRISPR/CAS9處理后K1細胞中Ku80蛋白表達 收集生長狀態(tài)良好的感染后K1細胞,提取總蛋白,測定蛋白濃度。將稀釋的抗體,稀釋變性的蛋白樣本及其他試劑按設定程序加入板中,使用全自動蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)(WES)檢測K1-Cas9穩(wěn)定株細胞中Ku80的蛋白表達量。蛋白上樣量1 μg,一抗兔抗人Ku80抗體稀釋比例為1 ∶300。使用普諾森二抗兔IgG試劑盒。目的條帶83 kD。檢測結(jié)果經(jīng)Compass軟件進行灰度分析。

1.2.6 qPCR檢測經(jīng)CRISPR/CAS9處理后B-CPAP細胞中Ku80相關mRNA的表達豐度 收集培養(yǎng)狀態(tài)良好的CRISPR/CAS9處理后細胞B-CPAP,提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用real time PCR方法檢測Ku80相關mRNA的表達情況,內(nèi)參基因GAPDH,引物由吉凱基因設計和合成。

1.2.7 MTT法檢測Ku80敲減對細胞增殖能力的影響 將處于對數(shù)生長期的實驗組(KO)、陰性對照組(NC)、空病毒組(CON)三組細胞胰酶消化,重懸成細胞懸液并計數(shù),接種5張96孔板。接種細胞數(shù)2 000個/孔,每組3孔。放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)終止前4 h加入20 μl 5 mg/ml的MTT于孔中,4 h后完全吸去培養(yǎng)液,加入100 μl DMSO。振蕩器振蕩2-5 min,酶標儀490/570 nm檢測OD值(在進行細胞MTT實驗中,一般以490 nm為檢測波長,570 nm為參考波長,兩者吸收光之差可以消除非特異波長,故以此來表示)。獲取K1及B-CPAP細胞隨時間變化(1-5 d)的OD490值及OD490變化倍數(shù),繪制時間-效應曲線。

1.2.8 Ku80敲減對細胞侵襲的影響 使用Corning侵襲試劑盒,按照試劑盒說明書操作,準備侵襲小室,接種細胞(細胞數(shù)為50 000/孔)至小室。培養(yǎng)體系為24孔板,內(nèi)室500 μl/孔,外室750 μl/孔。實驗分實驗組KO、陰性對照組NC、空病毒感染組MOCK組三組,每組3孔。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h。Giemsa染色,晾干。顯微鏡拍照、隨機選取5個鏡下視野計數(shù)、進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.9 細胞克隆形成實驗 將處于對數(shù)生長期的各組細胞胰酶消化,分組同1.2.8侵襲實驗,重懸成細胞懸液接種于6孔板中,在培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)13 d,熒光顯微鏡下照相,多聚甲醛固定細胞,PBS洗滌,Giemsa染色,晾干,數(shù)碼相機拍照,顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細胞的克隆數(shù),最后計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%,兩組細胞克隆形成率以配對樣本的秩和檢驗作統(tǒng)計分析;P<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

1.2.10 細胞凋亡檢測 實驗分三組進行,分組同1.2.8侵襲實驗,當6孔板細胞生長至覆蓋率約為85%時藥物誘導凋亡,若為貼壁細胞,則上清中細胞也需收集。胰酶消化,完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液,與上清細胞收集于同一5 ml離心管中,每組設三個復孔,若為懸浮細胞,直接收集。1 300 r/min離心5 min,棄上清,4 ℃預冷的D-Hanks(pH=7.2-7.4)洗滌細胞沉淀。1×binding buffer洗滌細胞沉淀一次,1 300 r/min、3 min離心,收集細胞。200 μl 1×binding buffer重懸細胞沉淀。加入10 μl Annexin V-APC染色,室溫避光10-15 min。根據(jù)細胞量,補加400-800 μl 1×binding buffer,上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR技術(shù)檢測Ku80 mRNA分別在K1、B-CPAP細胞中的表達

RT-PCR技術(shù)定量檢測Ku80 mRNA在不同細胞中的表達豐度。通過溶解曲線分析,結(jié)果均為單一峰,說明PCR擴增特異性較好,樣本3次重復試驗數(shù)據(jù)的重復性較好。從定量PCR結(jié)果可以看出,Ku80基因在兩株細胞中的表達豐度均為高豐度(見圖1)。

1.K1細胞株; 2.B-CPAP細胞株; M.DNA Marker DL 1000(TAKARA,Code No. D526A)

2.2 應用CRISP/CAS9系統(tǒng)感染K1及B-CPAP細胞后對Ku80表達的影響

K1及B-CPAP細胞鋪板,進行Puromycin抗體標記的Cas9-Puro慢病毒感染后,篩選后得到穩(wěn)定表達CAS9的混合克隆細胞株,繼續(xù)進行LV-XRCC5-sgRNA慢病毒感染。通過Cruiser酶切檢測CAS9-sgRNA活性可以看出K1-cas9-穩(wěn)定株實驗組所對應的KO1、KO2、KO3靶點及B-CPAP-cas9-穩(wěn)定株實驗組對應的KO靶點(與K1細胞中KO1序列一致)均檢測出活性,靶點序列如1.2.2所示。結(jié)果提示穩(wěn)定表達CAS9及LV-XRCC5-sgRNA的慢病毒感染成功(見圖2)。

2.3 CRISPR/CAS9處理后K1細胞及B-CPAP細胞中Ku80表達水平測定

檢測結(jié)果經(jīng)Compass軟件進行灰度分析,發(fā)現(xiàn)在K1-Cas9穩(wěn)定株細胞中Ku80表達量相對于對照組顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。qPCR檢測CRISPR/CAS9系統(tǒng)處理后B-CPAP細胞中Ku80mRNA的表達豐度,結(jié)果顯示:B-CPAP細胞中,實驗組Ku80mRNA表達水平是對照組的0.443倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),可進行基因敲減后的功能試驗研究(見圖3)。

2.4 Ku80敲減后對K1、B-CPAP細胞增殖、凋亡、侵襲及克隆形成的影響

Cas9病毒與sgRNA病毒共同感染目的細胞后,K1細胞,實驗組(KO)細胞第5天增殖活力及侵襲細胞數(shù)量,較對照組均顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而B-CPAP細胞,實驗組(KO)細胞第5天增殖活力及侵襲細胞數(shù)量較對照組(NC)呈下降趨勢,但無統(tǒng)計學差異(見圖4,5)。細胞凋亡檢測結(jié)果顯示,K1細胞KO組細胞凋亡較對照組顯著升高[(10.38±0.42)%vs(2.41±0.33)%];B-CPAP細胞KO組細胞凋亡數(shù)較對照組顯著升高[(7.91±0.34)%vs(4.61±0.17)%];兩株細胞凋亡差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖6)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示:相比對照組,實驗組敲減Ku80表達的K1、B-CPAP細胞克隆形成細胞數(shù)量均顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖7)。

M. DL2502 Ladder Marker(條帶從小到大分別為100,250,500,750,1 000,1 500,2 000,3 000,5 000 bp);KO1-3.實驗組對應的3個靶點;KO.實驗組對應的1個靶點;NC.各實驗組對應的陰性對照;CON.實驗組對應的空細胞對照;陽參:擴增片段大小為493 bp,酶切片段大小分別為122 bp、371 bp

圖3 CRISPR/CAS9處理K1細胞及B-CPAP細胞后Ku80敲減效率測定Figure 3 Ku80 knockdown efficiency in K1 cells and B-CPAP cells after treatment by CRISPR/CAS9

3 討論

乳頭狀甲狀腺癌(PTC)是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤。過去20年來,由于對偶發(fā)結(jié)節(jié)的檢測技術(shù)得到改善,PTC的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)穩(wěn)步上升。PTC占所有甲狀腺癌的80%-85%,且很大程度上可以治愈,其5年生存率為98%[8]。然而,5%-20%的病例發(fā)生疾病復發(fā),并且是患者死亡的重要原因。因此,在初次確診PTC時,風險評估和進展性預測非常重要[9,10]。

分子生物標志物因其在PTC中的診斷和預后標志物的潛在用途而被廣泛認可。Ku蛋白是由Ku80與Ku70兩亞基緊密結(jié)合形成的異二聚體結(jié)構(gòu),在DNA末端具有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性,能激活相關蛋白表達。在電離輻射造成的雙鏈DNA斷裂(DSBs)的同源末端結(jié)合和非同源末端結(jié)合修復途徑中發(fā)揮重要作用[11,12]。研究發(fā)現(xiàn)Ku蛋白表達存在一種精細的平衡,Ku蛋白的過度表達促進致癌基因表型,包括高增殖和抗凋亡性[13],然而表達不足或低表達Ku蛋白會導致基因不穩(wěn)定和腫瘤的形成[14]。有研究表明Ku80可以作為黏附分子并在細胞黏附、遷移和侵襲中發(fā)揮作用[15,16]。此外,譚卉妍等[17]的研究表明,Ku80具有多種生物活性,參與DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),可獨立參與細胞抗凋亡,并且在治療前列腺癌中,沉默Ku80的表達,可以顯著提高細胞對放療的敏感性。嚴姍姍等[18]通過回顧性分析223例鼻咽癌患者組織標本中Ku80表達與臨床病理特征相關性提示,Ku80的表達與腫瘤N分期、M分期有關,這說明Ku80可能與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移行為相關。Ku作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑通過與重組信號結(jié)合蛋白Jκ和核因子NF-κB p50同二聚體相互作用而上調(diào)p50的表達,可能調(diào)節(jié)胃癌細胞的增殖[19]。

圖4 K1及B-CPAP細胞增殖變化曲線Figure 4 K1 and B-CPAP cell proliferation curve

與NC組比較,*P<0.05

與NC組比較,*P<0.05

本課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ku80在PTC癌組織中較正常癌旁組織呈高表達,且與腫瘤TNM分期有一定的相關性。與其他腫瘤中Ku表達研究結(jié)果一致,為了更進一步探究Ku80在甲狀腺乳頭狀癌中的具體功能,我們采用CRISPR/CAS9技術(shù),敲減甲狀腺乳頭狀癌細胞中的Ku80表達,通過MTT、細胞凋亡、細胞侵襲及克隆形成實驗發(fā)現(xiàn),抑制Ku80表達,K1腫瘤細胞增殖、侵襲及克隆形成數(shù)目均顯著降低,且可有效誘導細胞凋亡。雖然在MTT實驗及細胞侵襲實驗中B-CPAP細胞的增殖活力和侵襲率與對照組相比并無差異,但是整體趨勢是細胞的增殖和侵襲能力受到抑制;為此,我們考慮到Ku80在細胞中表達豐度極高,CRISPR/CASE9技術(shù)敲減后B-CPAP細胞Ku80的敲減效率僅達到55.7%,仍有一定量的Ku80發(fā)揮作用,因此對B-CPAP細胞增殖、侵襲功能無顯著影響?？傮w來說,此研究結(jié)果提示Ku80過表達可能在PTC的發(fā)生、發(fā)展中起到促進作用。

癌癥的發(fā)生是一個復雜的過程,某種通路中相關基因的突變或者異位等均可導致腫瘤細胞的增殖與凋亡,常見的基因突變包括BRAF、RET、RAS、PTEN等,基因易位如RET/PTC等[20]。為此,本課題下一步擬通過檢測RET、NF-κB等在PTC組織中的表達來進一步研究其與Ku80蛋白在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展中具體通過哪些信號通路發(fā)揮作用。以相關靶基因為目的基因是目前甲狀腺乳頭狀癌精準治療和個體化治療的關鍵所在,本研究發(fā)現(xiàn),PTC癌組織Ku80陽性表達率高于癌旁組織,Ku80表達下調(diào)可抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和克隆形成能力,誘導細胞凋亡。但其具體的作用機制仍有待于進一步的研究。