鄭婷婷，蔣珊珊，方鐘燎，陳茂偉

近年來，有研究表明腸道微生態(tài)系統(tǒng)與疾病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有一定的聯(lián)系[1]。國內(nèi)外多項研究發(fā)現(xiàn)肝病患者存在不同程度的腸道菌群失調(diào)和腸黏膜生物屏障破壞，而在肝衰竭（LF）伴有相關(guān)并發(fā)癥的患者中尤為明顯，因此提出了“腸-肝軸”的概念[2]。為了解HBV感染導致的肝病患者腸道菌群的變化特點，我們應(yīng)用宏基因組學中的高通量16SrDNA測序法分析了慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化（LC）和LF患者的腸道菌群,旨在闡明腸道菌群在肝病發(fā)展中的作用，探討隨著肝功能的改變，腸道微生態(tài)是否發(fā)生動態(tài)變化甚至失衡，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源 2016年3月～2017年3年廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院住院的CHB患者23例，男性15例，女性 8例，平均年齡（32.45±13.17）歲；失代償期LC患者20例，男性9例，女性11例，平均年齡（44.28±5.35）歲；LF患者6例，男性4例，女性2例，平均年齡（50.28±9.84）歲和成年健康人9例，男性5例，女性4例，平均年齡（37.28±12.08）歲。診斷參照2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》或2012年版《肝衰竭診治指南》。排除標準：（1）近1個月內(nèi)使用過抗生素或微生態(tài)調(diào)節(jié)劑等影響腸道微生態(tài)的藥物者；（2）近1個月內(nèi)發(fā)生過除HBV以外的其他病毒、細菌、真菌感染者；（3）近1個月內(nèi)有過腹瀉或腸道疾病史者；（4）素食者。

1.2 糞便基因組16SrDNA測定 采集糞便時，避免尿液污染，用一次性采樣勺采集新鮮糞便放入冰盒，立即轉(zhuǎn)運至實驗室，稱取約200～220 mg，分裝于EP管，迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存。為防止腸道菌群DNA降解，以上采集和分裝過程在30 min內(nèi)完成。將糞便200 mg與GSL緩沖液1.4 ml混勻，置于70℃溫浴內(nèi)孵育5 min，旋渦15 s，12000 r/m離心1 min，加入蛋白酶proteinase K 15 μl和GB緩沖液200 μl，70℃溫浴箱內(nèi)孵育10 min，無水乙醇沉淀DNA過柱洗脫后溶解于TB洗脫緩沖液50 μl中。為增加基因組DNA得率，收集的溶液再次加入吸附柱GR2中，溫室靜置，12000 r/m離心2 min，-20℃保存。采用QubitFluorometer熒光劑檢測DNA濃度，將樣品在冰上融化，充分混勻并離心，取適量樣品進行檢測。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。檢測參數(shù)：膠濃度：1%；電壓：150 V；電泳時間：40 min。檢測的58例樣品均為A類質(zhì)量，符合構(gòu)建DNA文庫及測序的要求。將DNA樣品送深圳華大基因公司，使用illuminaMiseq平臺測序，將序列加在DNA片段的兩端以構(gòu)建文庫，將文庫中的DNA加載于流動細胞槽上，文庫兩端的通用接頭與流動細胞槽基底上的寡聚核苷酸序列互補配對。以流動細胞槽表面所固定的接頭為模板，進行橋式擴增，形成一個簇（cluster），采用邊合成邊測序法測16SrDNA序列。將原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)過去除接頭污染reads[默認adapter序列與read序列有15 bp的重疊（overlap），因此設(shè)置為15 bp，允許錯配數(shù)為3]；去除低質(zhì)量reads（默認 read 長度的 20%，設(shè)置 15 bp）;去除低復雜reads（默認read中某堿基連續(xù)出現(xiàn)的長度＞10，設(shè)置10 bp），最終得到清除數(shù)據(jù)（clean data）。

1.3 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行分析，組間腸道菌群的差異性分析采用單因素方差分析，P≤0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。應(yīng)用COPE軟件（connecting overlapped pair-end）分析，將不同相似度的序列歸并到不同的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。然后，通過OTU注釋完成OTU的物種分類。應(yīng)用mothur（v1.31.2，http://www.mothur.org/）[3]軟件包對OTU 物種進行注釋，結(jié)合微生物物種組成信息綜合分析，得到特定樣品中每個微生物物種的豐度信息。

2 結(jié)果

腸道菌種變化指腸道微生物群落中菌群種類的改變情況。本文根據(jù)各樣本基因檢測結(jié)果并與腸道菌群基因數(shù)據(jù)庫進行比對，運用OTU進行腸道菌種分類，通過物種注釋分析對58例樣品中OTU進行種屬分類學鑒定，統(tǒng)計每2個樣品在門、綱、目、科、屬、種水平上的構(gòu)成。鑒于綱、目、科分類，發(fā)現(xiàn)其水平與門水平未顯現(xiàn)出顯著性差異，而種水平菌種數(shù)量繁多，因此我們選取具有代表性的門和屬水平進行分析，結(jié)果如下。

2.1 門分類等級細菌分布情況 在門分類水平，健康組、CHB組、LC組和 LF組均以厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主。廣古菌門（Euryarchaeota）僅在健康人群中存在，梭桿菌門（Fusobacteria）在除LF組外的其他各組均有出現(xiàn)，且均較健康人體內(nèi)的數(shù)量多（圖1）。

2.2 屬分類等級細菌分布情況 在屬分類水平健康組、CHB組、LC組和LF組（圖2）中，共鑒定出100余種菌屬。每個樣本均以擬桿菌屬（Bacteroidetes）為主，其次為普氏菌屬（Prevotella）、梭菌屬（Fusobacterium）。此外，氨基酸球菌屬（Acidaminococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）僅在CHB組、LC組和LF組中出現(xiàn)。異斯氏菌屬（Alloscardovia）僅在健康組中出現(xiàn)。

圖1 各組門分類水平物種細菌分布profiling柱狀圖

圖2 各組屬分類水平物種細菌分布profiling柱狀圖

2.3 門分類水平菌群結(jié)構(gòu)比較 四組菌群結(jié)構(gòu)在門分類水平上有較大的差異，其中CHB組擬桿菌門（bacteroidetes）豐度（617.83）多于 LC 組（343.16）、LF組（182.15）和健康組（236.66），LC組變形菌門（proteobacteria）豐度（183.16）較 CHB 組（35.86）、LF組（18.87）和健康組（53.40）增多，LC 組厚壁菌門（firmicutes）豐度（402.58）與 LF組豐度（395.23）相似（表1）。具體差異有無統(tǒng)計學意義尚待進一步分析。

表1 各組門分類水平菌種豐度

2.4 各組屬分類水平菌群結(jié)構(gòu)比較 CHB組、LC組、LF組和健康組均以擬桿菌屬（bacteroidetes）為主，其中LC組擬桿菌屬豐度（150.28）較CHB組（184.53）、LF 組（175.07）和健康組（290.28）減少，CHB組普氏菌屬（prevotella）豐度（345.28）比 LC 組（46.75）、LF 組（5.63）和健康組（20.14）增多，LF 組韋榮氏球菌屬（veillonella）豐度（120.62）多于 CHB組（22.28）、LC 組（102.97）和健康組（1.46）。

2.5 樣品組間顯著性差異分析 在門分類水平，CHB和LF患者擬桿菌門豐度顯著高于健康人（P＜0.05），而LC患者與健康人比，無顯著性差異（P＞0.05）；LC患者變形菌門豐度顯著高于LF（P=0.006），LF患者變形菌門高于健康人和CHB患者（P＜0.05），其余無統(tǒng)計學意義；在屬分類水平，CHB患者擬桿菌屬、普氏菌屬、shuttleworthia屬豐度較健康人（為0）增加（P＜0.05），希瓦氏菌屬和噬膽菌屬豐度比健康人減低（P＜0.05）；LC 組和 LF組 Blautia屬、普氏菌屬、噬膽菌屬豐度均比健康人減少（P＜0.05）。同時，LC組Oribacterium、Selenomonas和 LF 組 Ruminococcus、Roseburia、Parabacteroides、Odoribacter、Holdemania菌屬缺失（豐度為0）；LC患者糞球菌屬豐度比CHB患者少（P=0.04）；LF患者糞球菌屬、十八梭菌屬較CHB患者豐度減少（P＜0.05），其余無統(tǒng)計學意義。

3 討論

腸道微生態(tài)系統(tǒng)是人體最大的微生態(tài)系統(tǒng)，含有人體最大的貯菌庫[4]。人體腸道棲居著數(shù)千種微生物，其菌種達到1000多種，約為人體自身細胞數(shù)目的10倍[5]。以厚壁菌門（Frimicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）兩類為主，總數(shù)超過90%[6]。我們應(yīng)用OTU在門、屬分類水平上對HBV感染性肝病患者腸道菌群進行分析，并應(yīng)用統(tǒng)計學方法分析腸道菌群在各組間的豐度差異性，分析出導致樣品組成差異的物種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，門、屬分類上總體趨勢以擬桿菌（Bacteroidetes）主，與近年來許多研究結(jié)果相符[6]。我們在門分類水平研究中發(fā)現(xiàn)在CHB組擬桿菌門豐度最多，在LC組變形菌門最多。擬桿菌屬于革蘭氏陰性菌，當其死亡溶解后會釋放出細胞壁中的脂多糖，有可能與CHB患者常伴發(fā)的內(nèi)毒素血癥有關(guān)[7]。變形菌具有高活性的尿素酶，能分解尿素產(chǎn)生氨，經(jīng)血液吸收后血氨升高[8]。血氨升高是LC患者發(fā)生肝性腦病的常見誘因。梁友方[8]等人研究發(fā)現(xiàn)，變形桿菌感染是LC患者高血氨癥發(fā)生的影響因素之一。

單從門的層面探討腸道菌群的結(jié)構(gòu)及組間差異是不全面的。門是一個較為大致的分類層面，同一個門下包含多個種屬，其中既有有益菌也有致病菌，因此我們選擇較為細致的屬層面進行分析。研究發(fā)現(xiàn)，在屬分類上共鑒定出100余種菌屬，各研究菌屬表現(xiàn)較大的差異性，在健康組和CHB組以擬桿菌屬為主，比例在20%～40%，其具有促進上皮細胞成熟、修復上皮組織，幫助營養(yǎng)吸收的作用[9]。有報道稱，健康成年人腸道優(yōu)勢菌群主要由擬桿菌和厚壁菌下的優(yōu)勢菌屬構(gòu)成[10]，本研究結(jié)果與之相符。此外，在CHB組，普氏菌屬較健康組豐度增加，而普氏菌屬屬于擬桿菌門。Tamura et al研究發(fā)現(xiàn)，普氏菌表面的LPS可誘導IL-8基因表達，增強炎癥反應(yīng)[11]。據(jù)報道，已有20種普氏菌屬下的細菌被證明會引起人體多部位感染[12]。本研究發(fā)現(xiàn)CHB組和LC組噬膽菌屬較健康組減少，考慮為肝病患者膽汁分泌異常和腸道環(huán)境不利于其增殖有關(guān)。Blautia屬和韋榮是球菌屬均為產(chǎn)短鏈脂肪酸（SCFA）菌屬[13]，而SCFA有保護腸道屏障并改善機體炎癥狀態(tài)的作用[14]。另外，LC組和LF組菌屬構(gòu)成無明顯差異，而且大部分菌屬較CHB組和健康組豐度缺失，可能因為LC和LF都是肝臟慢性進行性損害的終末表現(xiàn)，肝功能減退和門脈高壓造成腸黏膜淤血水腫，一氧化碳（NO）生成增多，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)和腎上腺素能活性升高，都會損傷腸道黏膜，從而使腸道蠕動減慢，小腸排空時間延長，導致菌群過度生長[15]，而這個過程中以革蘭陰性菌增多為主[16]。內(nèi)環(huán)境的變化使一些有益菌減少，致病菌增多[17]，隨著肝功能的減退，菌種多樣性減少，趨于單一。研究還發(fā)現(xiàn)僅在健康組出現(xiàn)了異斯氏菌屬，目前還沒有相關(guān)研究報道，我們也還不明白其意義。

綜上所述，HBV感染患者存在腸道菌群的改變，但越來越多證據(jù)顯示腸道菌群存在菌群失調(diào)，腸道菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化是導致疾病進展的一個重要因素[18]。肝臟疾病患者腸道菌群的平衡關(guān)系被打亂，肝臟功能降低，炎癥反應(yīng)被激活，腸道菌群失調(diào)和腸壁通透陛增加，又進一步加重肝臟負荷，打破“腸-肝軸”的平衡。目前，已證實腸道菌群與炎性腸病[19]、非酒精性脂肪肝[20]、肝硬化[4]等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。